检测马铃薯X病毒用的引物、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种检测马铃薯X病毒用的引物、试剂盒及方法，其中引物包括PVX‑F3；PVX‑B3；PVX‑FIP；PVX‑BIP。本发明专利技术的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种快速、简便、高效、准确性高、特异性强、灵敏性高，马铃薯X病毒RT‑LAMP检测用的引物；本发明专利技术另一个目的是提供一种包含上述引物的用于检测马铃薯X病毒的试剂盒；本发明专利技术另一个目的是提供一种采用上述马铃薯X病毒RT‑LAMP检测方法。

Primers, kits and methods for detection of potato virus X

The invention discloses a primer, a kit and a method for detecting potato virus X, wherein primers include PVX F3, PVX B3, PVX FIP, PVX BIP. The aim of the invention is to overcome the shortcomings of the existing technology and provide a primer for the detection of potato X virus RT LAMP, which is rapid, convenient, efficient, high accuracy, high specificity and high sensitivity, and another purpose of the invention is to provide a kit for detecting the potato X virus with the above primers; Another object of the invention is to provide a detection method of potato virus X RT LAMP.

【技术实现步骤摘要】
检测马铃薯X病毒用的引物、试剂盒及方法
本专利技术涉及一种马铃薯X病毒RT-LAMP鉴定用的引物、试剂盒及检测方法，属于生物

技术介绍
马铃薯X病毒PotatovirusX，PVX又称马铃薯潜隐病毒Potatolatentvirus或马铃薯轻花叶病毒Potatomildmosaicvirus，为马铃薯X病毒属Potexvirus模式成员，是由一条正链RNA组成的线性病毒，RNA长约6.4kbp，病毒粒子呈长杆状，长×宽＝515nm×13nm。自然条件下主要靠寄主植株不同部位、寄主植株之间接触摩擦进行机械传播。PVX单独侵染时症状较轻，与马铃薯Y病毒PotatovirusY，PVY、烟草脉斑驳病毒Tobaccoveinmottlingvirus，TVMV、烟草蚀纹病毒Tobaccoetchvirus，TEV等马铃薯Y病毒属病毒复合侵染时症状加剧，造成严重经济损失。所有马铃薯Solanumtuberosum产区均存在PVX发生的现象，但不同栽培品种受PVX侵染情况存在较大差异，有些品种带毒率较高。在田间，PVX侵染马铃薯植株，引起轻型花叶或者潜隐病征，若多年侵染则易引起重花叶或者植株矮化，造成10％-80％减产。PVX常与PVY复合侵染，使症状加剧。PVX主要靠汁液接触传播，也可以由某些昆虫如异黑蝗Melanoplusdifferentialis和绿丛螽斯Tettigoniaviridissima的咀嚼式口器经机械作用传播，菟丝子Cuscutacampestris和集合油壶菌Synchytiumendobiotcum也能够传播该病毒，但实生种子不能传毒。PVX寄主范围较广，可侵染16科240种植物，茄科植物是主要的寄主，其诊断寄主有白肋烟Whiteburley及其他烟草Nicotianatabacum品种。初侵染的叶片通常表现为坏死斑，之后发展为坏死斑驳、褪绿、花叶或脉褪绿。在曼陀罗Daturastramonium上继斑驳之后产生褪绿环，脉褪绿或脉坏死。烟草栽培品种适于作繁殖寄主。千日红Gomphrenaglobosa是较好的指示植物，除HB株系外都产生局部斑。对于PVX株系的分类还未有统一的标准，但Cockerham的方法认可度较高，该方法根据PVX侵染携带不同抗病基因Nx和Nb的马铃薯植株所表现出的症状，将PVX株系分为4组，分别是X1、X2、X3和X4。X1组如CS35株系在含Nx、Nb基因的马铃薯上均能引起过敏反应Hypersensitiveresistance，HR。X2组如CP株系只在含Nb基因的马铃薯上引起HR。X3组如UK3、DX株系只在含有Nx基因的马铃薯上引起HR。X4组如DX4、CP4、HB株系则能完全克服Nx、Nb抗性。许多研究表明，PVX的外壳蛋白Coatprotein，CP基因在决定PVX与植物抗病基因互作方面起着重要作用。CP可作为激发子使马铃薯产生HR、ER,极端抗病性extremeresistance，ER反应，CP基因核苷酸序列的变化会导致寄主产生不同的症状类型。因此，PVX的CP基因序列分析也有助于对PVX的分类研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种快速、简便、高效、准确性高、特异性强、灵敏性高，马铃薯X病毒RT-LAMP鉴定用的引物；本专利技术另一个目的是提供一种包含上述引物的用于鉴定马铃薯X病毒的试剂盒；本专利技术另一个目的是提供一种采用上述马铃薯X病毒RT-LAMP鉴定方法。为了达到上述目的，本专利技术采用以下方案：一种马铃薯X病毒RT-LAMP鉴定用的引物，其特征在于包括：PVX-F3:5’-AGGCCTGTTCACTATCCCG-3’PVX-B3:5’-TGATGCCGTTGGAATAGGGA-3’PVX-FIP:5’-GCCTCAATCTTGCTGAGGTCCT-AGCCCGTGCCATAGTAGC-3’PVX-BIP:5’-AAGGTGCCCACAGACACTATGG-CTGTTTGAGCGGATGATCCT-3’。一种马铃薯X病毒RT-LAMP鉴定用的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括有：如上所述的试剂盒，其特征在于所述的2×反应液缓冲液由以下组分组成：如上所述的试剂盒，其特征在于所述的酶溶液为BstDNA聚合酶和AMV逆转录酶混合液。如上所述的任一种试剂盒，其特征在于荧光目视检测试剂中含有钙黄绿素荧光染料。一种马铃薯X病毒鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：A、植物组织总DNA提取；B、LAMP检测：采用权利要求2所述的试剂盒配置预反应溶液，在预反应溶液中分别加入待检测的样品的DNA5μL，使总量达到25μL；其中对照组在预反应溶液加入去离子水5μL；阳性对照在预反应溶液中加入带病毒的DNA5μL；用移液器吸排液法混合，或者合上盖子轻击使溶液充分混合后瞬时离心，混合时避免产生气泡；将混合物置于反应孔中，于65℃恒温反应90min，最后80℃下保温5min以结束反应；C、LAMP结果判断扩增反应结束后，使用紫外线照射装置，波长240-260nm，350-370nm，从反应试管底部向上进行紫外线照射，佩戴眼镜等防护用具后从反应试管侧面进行观察，若与阳性对照一样发出绿色荧光，则判定为阳性即样品中带有马铃薯X病毒；若与阴性对照一样未发出绿色荧光，则判定样品中没有携带马铃薯X病毒。如上所述的鉴定方法，其特征在于步骤A中植物组织总DNA提取的具体步骤：a制样：取0.5g的带毒组织加入1mL抽提缓冲液进行研磨；b清洗纳米磁珠：取出免疫纳米磁珠到PCR管中，用ddH2O反复清洗纳米磁珠3次，在磁铁的作用下吸去ddH2O；c结合：加入100μL的样品到PCR管中，用移液枪吸吐混匀样品和纳米磁珠，室温下吸附；d清洗：在磁铁的作用下移去上清，纳米磁珠清洗3次；e裂解：加入50μLddH2O到PCR管中,用移液枪吸吐混匀纳米磁珠后，95℃，10min；f取样：用磁铁吸附纳米磁珠，待PCR管内溶液澄清后，上清即为病毒RNA；g核酸浓度的测定取5μLDNA溶液加ddH2O梯度稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的光密度值；RNA的浓度按照以下公式计算获得：RNAC＝40×N×A式中：C——RNA浓度(ng/μL)A——260nm处的吸光值N——核酸稀释倍数1OD260nm＝40μg/mL单链RNA当OD260/OD280比值在1.7～1.9之间时，适宜于PCR扩增和LAMP检测。如上所述的鉴定方法，其特征在于所述纳米磁珠通过以下方法制备：1)Fe3O4磁性纳米粒子制备与氨基化修饰分别取5.2gFeCl3·6H2O、2.7gFeSO4·7H2O、0.85mL12.1moL/L的浓盐酸溶解于200mL水中，超声脱氧，后将以上溶液滴入250mL、0.75moL/LNaOH溶液；所有反应在80℃下搅拌，随着反应的进行，反应液中出现黑色的沉淀，反应结束后，利用磁分离器将所得沉淀从反应介质中分离出来，再用去离子水清洗3次，无水乙醇清洗2次，并配成5g/mL的Fe3O4磁性纳米粒子无水乙醇溶液，取25mLFe3O4磁性纳米粒子无水乙醇溶液，再用无水乙醇稀释到150mL，超声振荡30min，滴加0.4mLAPTES，其中硅本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测马铃薯X病毒用的引物，其特征在于包括：PVX‑F3:5’‑AGGCCTGTTCACTATCCCG‑3’PVX‑B3:5’‑TGATGCCGTTGGAATAGGGA‑3’PVX‑FIP:5’‑GCCTCAATCTTGCTGAGGTCCT‑AGCCCGTGCCATAGTAGC‑3’PVX‑BIP:5’‑AAGGTGCCCACAGACACTATGG‑CTGTTTGAGCGGATGATCCT‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种检测马铃薯X病毒用的引物，其特征在于包括：PVX-F3:5’-AGGCCTGTTCACTATCCCG-3’PVX-B3:5’-TGATGCCGTTGGAATAGGGA-3’PVX-FIP:5’-GCCTCAATCTTGCTGAGGTCCT-AGCCCGTGCCATAGTAGC-3’PVX-BIP:5’-AAGGTGCCCACAGACACTATGG-CTGTTTGAGCGGATGATCCT-3’。2.一种检测马铃薯X病毒用的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括有：3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的2×反应液缓冲液由以下组分组成：4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的酶溶液为BstDNA聚合酶和AMV逆转录酶混合液。5.根据权利要求2至4所述的任一种试剂盒，其特征在于荧光目视检测试剂中含有钙黄绿素荧光染料。6.一种马铃薯X病毒检测方法，其特征在于包括以下步骤：A、植物组织总DNA提取；B、LAMP检测：采用权利要求2所述的试剂盒配置预反应溶液，在预反应溶液中分别加入待检测的样品的DNA5μL，使总量达到25μL；其中对照组在预反应溶液加入去离子水5μL；阳性对照在预反应溶液中加入带病毒的DNA5μL；用移液器吸排液法混合，或者合上盖子轻击使溶液充分混合后瞬时离心，混合时避免产生气泡；将混合物置于反应孔中，于65℃恒温反应90min，最后80℃下保温5min以结束反应；C、LAMP结果判断扩增反应结束后，使用紫外线照射装置，波长240-260nm，350-370nm，从反应试管底部向上进行紫外线照射，佩戴眼镜等防护用具后从反应试管侧面进行观察，若与阳性对照一样发出绿色荧光，则判定为阳性即样品中带有马铃薯X病毒；若与阴性对照一样未发出绿色荧光，则判定样品中没有携带马铃薯X病毒。7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于步骤A中植物组织总DNA提取的具体步骤：a制样：取0.5g的带毒组织加入1mL抽提缓冲液进行研磨；b清洗纳米磁珠：取出免疫纳米磁珠到PCR管中，用ddH2O反复清洗纳米磁珠3次，在磁铁的作用下吸去ddH2O；c结合：加入100μL的样品到PCR管中，用移液枪吸吐混匀样品和纳米磁珠，室温下吸附；d清洗：在磁铁的作用下...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈定虎，
申请(专利权)人：陈定虎，
类型：发明
国别省市：广东,44