一种引起大豆根腐病的镰孢菌属菌种的鉴定与区分方法技术

本发明专利技术涉及一种引起大豆根腐病的镰孢菌属菌种的鉴定与区分方法。根据形态学与用ITS序列构建的遗传进化树鉴定结果，根据扩增的ITS序列长度，用3％琼脂糖凝胶电泳将茄病镰孢菌和其它3类镰孢菌分开；比对剩下的3类镰孢菌ITS序列，找出特异性限制性内切酶的酶切位点BspCNI，AvaI及PstI；用这3种酶的不同组合酶解扩增的ITS序列，形成不同的CAPS分子标记，用1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，从而将这3类镰孢菌区分开。镰孢菌属中菌种鉴定与区分仅借助琼脂糖凝胶电泳与CAPS分子标记就可实现，该方法适应于大规模、高通量的菌种鉴定与区分，尤其适用于我国大豆产区引起大豆根腐病的主要镰孢菌的快速鉴定与区分。

Identification and identification of Fusarium species causing soybean root rot

The invention relates to a method for identification and differentiation of Fusarium species causing soybean root rot. According to the morphological and ITS sequence of genetic evolution tree identification results, according to the length of the amplified ITS sequence, 3% agarose gel electrophoresis was used to separate Fusarium Solanum and other 3 Fusarium species. Compared with the remaining 3 Fusarium oxysporum ITS sequence, the specific restriction endonuclease BspCNI, AvaI and PstI were found. The ITS sequences of different combinations of enzyme, forming different CAPS molecular markers, were separated by 1.5% agarose gel electrophoresis to separate the 3 Fusarium species. The identification and differentiation of the strains of Fusarium in the genus Fusarium can be realized only by agarose gel electrophoresis and CAPS molecular markers. This method adapts to the identification and differentiation of large and high throughput strains, and is especially suitable for rapid identification and differentiation of the main Fusarium oxysporum in soybean root rot disease in China.

【技术实现步骤摘要】
一种引起大豆根腐病的镰孢菌属菌种的鉴定与区分方法
本专利技术属于微生物及生物
，涉及一种引起大豆根腐病的镰孢菌属菌种的鉴定与区分方法。
技术介绍
准确鉴定病原菌的种类、了解病原菌的分布及生物学特性是采取有效措施防治作物病害的前提与基础。传统的病原菌鉴定和分类主要依赖于形态特征鉴别及致病性检测，耗时费力，并且不一定准确。随着分子生物学技术的发展，真菌的核糖体内转录间隔区(ITS)序列因其高度保守，被广泛应用于病原真菌的分类和鉴定(GuadetJ,JulienJ,LafayJF,BrygooY.PhylogenyofsomeFusariumspecies,asdeterminedbylarge-subunitrRNAsequencecomparison.MolecularBiologyandEvolution,1989,6,227-242；BrunsTD,TaylorJW.Fungalmolecularsystematics.AnnualReviewofEcologySystematics,2003,22,525-564)。然而在检测植物病原真菌时，有些菌种间的ITS序列差异很小，并不能有效地鉴定病原菌(TooleyPW,CarrasMM,FalkensteinKF.RelationshipsamonggroupIVPhytophthoraspeciesinferredbyrestrictionananalysisoftheITS2region.JournalofPhytopathology,1996,144,363-369)，并且这种方法需要测序。大豆根腐病是世界主要的油料作物和粮食作物大豆生产上危害最严重的病害之一，每年造成巨大的产量损失，并严重影响大豆的品质。大豆根腐病是一种毁灭性的真菌土传病害，其致病菌种类繁多，据报道主要的病原菌有：镰孢菌(Fusarium.spp)，腐霉菌(Pythium.spp)，立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)以及疫霉根腐菌(Phytophthorasojae)等。镰刀型根腐病在我国大豆主要产区均有发生，但受地域、气候、温度等的影响，各个地区的优势镰孢菌种类不同。如黑龙江省主要以尖孢镰孢菌为主(ZhangS,XuP,WuJ.RacesofPhytophthorasojaeandtheirvirulenceonsoybeancultivarsinHeilongjiang,China.PlantDisease,2010,94,87-91)，福建省、山东省等地区主要以茄病镰孢菌为主(WuM,ZhangH,LiX,ZhangY.Soilfungistasisanditsrelationstosoilmicrobialcompositionanddiversity:acasestudyofaseriesofsoilswithdifferentfungistasis.JournalofEnvironmentalSciences,2008,20,871-877；CuiL,YinW,TangQ.Distribution,pathotypes,andmetalaxylsensitivityofPhytophthorasojaefromHeilongjiangandFujianprovincesinChina.PlantDisease,2010,94,881-884；PanFJ,McLaughlinNB,YuQ.Responsesofsoilnematodecommunitystructuretodifferentlong-termfertilizerstrategiesinthesoybeanphaseofasoybean-wheat-cornrotation.EuropeanJournalofSoilBiology,2010,46,105-111)，陕西省一些地区则以茄病镰孢菌、尖孢镰孢菌及木贼镰孢菌为主要致病菌(刘铸德.大豆根腐病的研究.中国油料,1992,1,42-44)。镰孢型根腐病在中国的发生与危害日益严重，迫切需要低成本又准确的镰孢菌检测方法。目前，引起大豆根腐病的镰孢菌的鉴定及镰孢菌菌种间的区分大部分还是借助于传统的形态学和致病性检测双重方法以及ITS的测序方法。ITS序列的鉴定方法准确，但对于大规模的病菌鉴定成本还是挺高。
技术实现思路
本专利技术提供一种引起大豆根腐病的镰孢菌属菌种的区分与鉴别方法。本专利技术的目的是提供一种简洁、快速区分与鉴别引起大豆根腐病的镰孢菌属菌种的方法。本专利技术另一目的是提供一种高通量的、可适用于大规模区分与鉴别我国大豆产区引起大豆根腐病的主要镰孢菌属菌种的方法。专利技术思路：针对上述在我国大豆产区鉴定出的主要镰孢菌种类，根据镰孢菌ITS序列开发CAPS分子标记，借助琼脂胶凝胶电泳直接、快速鉴定与区分镰孢菌属的4个菌种：茄病镰孢菌、尖孢镰孢菌、木贼镰孢菌及Fusariumcommune的方法，该方法简洁、快速、无需测序，且适用于大规模、高通量镰孢菌的鉴定与区分，尤其适用于我国大豆产区引起大豆根腐病的镰孢菌的鉴定与区分。一种引起大豆根腐病的镰孢菌属菌种的区分与鉴别方法，包括如下顺序步骤：(1)通过形态学特征鉴定为镰孢菌属，(2)PCR扩增镰孢菌ITS序列，琼脂糖凝胶电泳得到不同长度的ITS序列；(3)比对不同种类镰孢菌的ITS序列，找出特异性限制性内切酶位点，用不同酶组合酶解扩增的ITS序列，形成不同的CAPS分子标记，琼脂糖凝胶电泳分离，得到各镰孢菌不同的电泳分离模式，从而区分镰孢菌属不同菌种。所述步骤(2)中PCR扩增采用下述引物ITS1F/ITS4：ITS1F：5'-cttggtcattttagaggaagtaa-3'，ITS4：5'-tcctccgcttattgatatgc-3'。所述菌种为茄病镰孢菌(Fusariumsolani)，木贼镰孢菌(Fusariumoxysporum)，尖孢镰孢菌(Fusariumequiseti)及FusariumCommune；所述茄病镰孢菌的ITS序列比其它3类镰孢菌的ITS序列长，用3％的琼脂糖凝胶电泳可直接将茄病镰孢菌和其它3类镰孢菌分开。所述步骤(3)中，其它3类镰孢菌的扩增产物用BspCNI+AvaI、BspCNI+PstI或BspCNI+AvaI+PstI进行酶解，酶解产物用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳分离。所述步骤(1)形态学特征鉴定包括菌丝、分生孢子梗、分生孢子及厚垣孢子的形态、颜色、大小、比例及发生部位，鉴定出真菌的种类，在显微镜下观察到单菌落的PDA培养物分生孢子为镰刀状而判定为典型的镰孢菌。上述目的通过以下技术方案实现：(1)采集大豆种植地里萎蔫了的大豆植株。采集到了大豆萎蔫植株11株。(2)用真菌培养基分离萎蔫植株病健组织交界处的真菌。分离到了18个单菌落克隆，每个单菌落作为一个分离菌(3)观察分离的真菌的形态学特征，包括菌丝、分生孢子梗、分生孢子及厚垣孢子等的形态、颜色、大小、比例及发生部位等，鉴定出真菌的种类。从18个单菌落的PDA培养物，在显微镜下观察到其中的17个分离菌为典型的镰孢菌，并且，根据形态学特征，这17个分离菌可分成4类不同的镰孢菌：第1类含1个真菌分离本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种引起大豆根腐病的镰孢菌属菌种的区分与鉴别方法，包括如下顺序步骤：(1)通过形态学特征鉴定为镰孢菌属，(2)PCR扩增镰孢菌ITS序列，琼脂糖凝胶电泳得到不同长度的ITS序列；(3)比对不同种类镰孢菌的ITS序列，找出特异性限制性内切酶位点，用不同酶组合酶解扩增的ITS序列，形成不同的CAPS分子标记，琼脂糖凝胶电泳分离，得到各镰孢菌不同的电泳分离模式，从而区分镰孢菌属不同菌种。

【技术特征摘要】
1.一种引起大豆根腐病的镰孢菌属菌种的区分与鉴别方法，包括如下顺序步骤：(1)通过形态学特征鉴定为镰孢菌属，(2)PCR扩增镰孢菌ITS序列，琼脂糖凝胶电泳得到不同长度的ITS序列；(3)比对不同种类镰孢菌的ITS序列，找出特异性限制性内切酶位点，用不同酶组合酶解扩增的ITS序列，形成不同的CAPS分子标记，琼脂糖凝胶电泳分离，得到各镰孢菌不同的电泳分离模式，从而区分镰孢菌属不同菌种。2.根据权利要求1所述的区分与鉴别方法，所述步骤(2)中PCR扩增采用下述引物ITS1F/ITS4：ITS1F：5'-CTTGGTCATTTTAGAGGAAGTAA-3'，ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。3.根据权利要求2所述的区分与鉴别方法，所述菌种为茄病镰孢菌(Fusariumsolani)，木...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘世名，郑娜，张刘萍，彭德良，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11