多粘类芽孢杆菌GY40及其可湿性粉剂的制备与用途制造技术

本发明专利技术公开了一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)GY40菌株，其保藏号为：CGMCC NO.14481。本发明专利技术还公开了多粘类芽孢杆菌GY40菌株的产芽孢发酵培养方法，以及利用多粘类芽孢杆菌GY40菌株制备菌粉和可湿性粉剂的方法。本发明专利技术菌株具有陆源微生物不具有的较强耐盐性，生长温度低，抑菌作用强的优点；其产芽孢发酵方法配方简单，原料主要为农产品下脚料，价格低廉，来源广泛，菌株生长速度快，发酵温度低，发酵时间短，发酵条件易于控制，发酵芽孢产量高，减少了原料成本，降低了发酵能耗，提高了发酵生产效率，该菌株制得的可湿性粉剂具有很好的防治小麦赤霉病、黄瓜枯萎病作用，可以用于小麦和黄瓜种植。

Preparation and application of Bacillus subtilis GY40 and its wettable powder

The invention discloses a Paenibacillus polymyxa GY40 strain, and its storage number is CGMCC NO.14481. The invention also discloses a method for producing spore producing fermentation of Bacillus spore bacillus GY40 strain, and the method of preparing bacteria powder and wettable powder by using Bacillus spore bacillus GY40 strain. The strain has the advantages of strong salt tolerance, low growth temperature and strong bacteriostasis, and its spore producing method is simple, the raw material is mainly agricultural product, low price, wide source, fast growth speed, low fermentation temperature, short fermentation time and easy to control fermentation conditions. The production of fermented spores is high, the cost of raw materials is reduced, the energy consumption of fermentation is reduced, and the efficiency of fermentation is improved. The wettable powder obtained by this strain has good effect on controlling wheat scab and Cucumber Fusarium wilt, and can be used for planting wheat and cucumber.

【技术实现步骤摘要】
多粘类芽孢杆菌GY40及其可湿性粉剂的制备与用途
本专利技术涉及一种源自海洋的菌株，特别是一种多粘类芽孢杆菌GY40菌株，本专利技术还涉及该多粘类芽孢杆菌GY40菌株的发酵培养方法，利用该菌株制备菌粉、可湿性粉剂的方法和用途。
技术介绍
芽孢杆菌可以产生抗逆性强的内生芽孢，芽孢适合储藏和运输，因此是开发的微生物菌剂的主要活性成分。目前研制成功的生防活菌制剂中大多数以芽孢为主要成分，研究菌株产芽孢培养基和发酵条件，提高发酵水平和芽孢产率是开发芽孢杆菌活菌制剂的关键，对于提高生产效率具有重要意义。多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus.polymyxa)中很多菌株作为重要的生防资源，用于多种植物病害的生物防治，该菌对人畜安全、无环境污染、对植物非致病性，在生产过程中活菌量高且产品稳定性强，是目前进行微生物农药规模化生产的理想菌属。美国环境保护署(EPA)已将其列为可商业上应用的微生物种类之一，我国农业部也将其列为免做安全鉴定的一级菌种。一些学者分离得到了多个多粘类芽孢杆菌优良菌株，系统研究了起抗菌防病作用。也有学者将筛选到的多粘类芽孢杆菌研制成了0.1×108CFU/g多粘类芽孢杆菌细粒剂(KDLD)，已登记并在生产上应用，对番茄青枯病具有良好的防效。海洋微生物生长在寡营养、低温、高盐等海洋环境中，因此会具有耐盐和低营养等特性，具有更广泛的适应性，容易培养，在环境中易于定殖，使得洋微生物的开发与研究具有巨大的潜力。不同学者在我国不同的海域分离到了一些能够抑制植物病原菌的海洋微生物菌株，如谢听等在其分离得到的8株对植物病菌具有抑制作用的的芽孢杆菌菌株，其中一株为多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)，在该菌株代谢产物中提取到细胞壁降解酶类活性物质；牛军等在东海海域分离得到了一株对几种植物病原真菌具有拮抗作用的海洋真菌；刘淼等在大连湾地区分离得到了一株海洋枯草芽孢杆菌，其对稻瘟病具有强烈的抑制作用，马桂珍等从连云港海域分离到一株多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus.polymyxa)L1-9菌株，该菌株发酵液对水稻纹枯病菌等17种植物病原菌具有抑制作用，并系统研究了该菌株产生抑菌物质的发酵条件，胡飞等人对分离自青岛海域海泥中的多粘类芽孢杆菌DN-1菌株产生芽孢固态发酵条件进行优化，得到了产芽孢固态培养基配方和发酵条件，但培养基组分含量较高，发酵温度高，时间长，产生的芽孢产量较低，固态发酵效率低。综上所述有关源自海洋的多粘类芽孢杆菌产芽孢液体发酵培养基和发酵条件的优化以及生防制剂的研制尚未见报道。针对现有的用于生防制剂开发的多粘类芽孢杆菌来自于陆源、产芽孢培养基成分复杂、发酵温度较高、发酵时间长、多粘类芽孢杆菌制剂芽孢含量低等不足，本专利采用单因素试验和正交试验对从连云港海域分离得到的一株具有强抗菌作用的多粘类芽孢杆菌(P.polymyxa)GY40菌株的产芽孢发酵培养基和摇瓶发酵条件进行优化，并在1吨发酵罐中进行放大试验，筛选与菌株生物相容性好的载体和助剂并优化其配比，制备以源自海洋的多粘类芽孢杆菌的芽孢为主要成分的可湿性粉剂，并用于黄瓜枯萎病和小麦赤霉病的防治，为海洋多粘类芽孢杆菌的开发提供原料来源广泛价格低廉的产芽孢培养基配方及其发酵工艺和可湿性粉剂配方。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，特别是生产上优良菌株较少、适应性差、培养温度较高等不足，提供一种源自海洋的耐盐、培养温度低、营养简单的新的多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)GY40菌株CGMCCNO.14481。本专利技术所要解决的另一个液体发酵芽孢产量低、培养基成分复杂成本高的技术问题，供述了前述源自海洋的多粘类芽孢杆菌GY40菌株芽孢产量高的液体发酵培养方法。本专利技术所要解决的再一个技术问题是根据现有多粘类芽孢杆菌制剂种类少、以及其活体可湿性粉剂中芽孢含量低的不足，提供利用多粘类芽孢杆菌GY40菌株制备芽孢含量高的菌粉和可湿性粉剂的方法。本专利技术所要解决的再一个技术问题是针对生产上黄瓜枯萎病和小麦赤霉病危害大防治有效药剂少或农药毒性高等不足提供可湿性粉剂的用途。本专利技术所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本专利技术是一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)GY40菌株，其特点是，其保藏号为：CGMCCNO.14481。本专利技术所涉及的多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)GY40菌株，已于2017年7月31日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，其保藏号为：CGMCCNO.14481，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，电话：010-64807355。本专利技术还公开了前述多粘类芽孢杆菌GY40菌株的产芽孢发酵培养方法，其特点是，其步骤如下：(1)将GY40菌株接种到PDA培养基上活化24h，在无菌条件下用接种环挑取GY40菌株于装有60mL种子液培养基的250mL三角瓶中，28℃，180r/min振荡培养16h；调整菌液浓度为109个细胞/mL，作发酵用种子液；所述种子液培养基配方为：葡萄糖20g/L、马铃薯200g/L、水1L；(2)将种子液按接种量为5％-10％接种于装有发酵培养基的发酵罐进行产芽孢发酵培养，搅拌速度为150r/min，在0～12h时通气量为14m3/h，12h后通气量调整为30m3/h，发酵时间为26h，得发酵液；发酵培养基配方为：葡萄糖0.24％，豆饼粉0.96％，玉米粉1.68％，硫酸镁0.36％，初始pH7.0。本专利技术还公开了一种利用所述的多粘类芽孢杆菌GY40菌株制备GY40菌粉的方法，其特点是，其步骤如下：将多粘类芽孢杆菌GY40菌株在发酵罐中按以上技术方案所述的方法进行产芽孢发酵培养，得到的发酵液用皂土为载体，并增加氯化钙和磷酸氢二钠进行吸附，板框过滤后，得到菌饼，干燥后得到GY40菌粉。其中：吸附所加入的氯化钙优选为发酵液体积的2％，所加入的磷酸氢二钠按优选为发酵液体积的3％。本专利技术还公开了一种利用所述的多粘类芽孢杆菌GY40菌株制备可湿性粉剂的方法，其特征在于点是，其步骤如下：取按以上技术方案所述的方法制得的GY40菌粉，按以下质量百分比向GY40菌粉中加入助剂：GY40菌粉70％，稳定剂海藻酸钠14％，湿润剂十二烷基苯磺酸钠8％，分散剂聚乙烯醇8％；混合均匀，粉碎后过300目筛，得到GY40菌株可湿性粉剂。以上所述的方法所制得的发酵液、GY40菌粉或者GY40菌株可湿性粉剂可以作为有效成份用来制造防治小麦赤霉病的药物或者药物组合物。也可以作为有效成份用来制造防治黄瓜枯萎病的药物或者药物组合物。以下是专利技术所做的相关的实验及其结果。1材料与方法1.1供试菌株从连云港海域采集海水、海泥、漂浮物、海洋动物、海洋植物等多种样品采用稀释涂布法分离到海洋细菌235株，以小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporiumf.sp.Cucumerinum)为指示菌，采用平板对峙法测定235个菌株的抑菌活性，得到抑制作用较强的海洋细菌58株，采用牛津杯法测定58个菌株的无菌发酵液对指示菌的抑制作用，有26个菌株发酵液对2种指本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种源自海洋的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)GY40菌株，其特征在于，其保藏号为：CGMCC NO.14481。

【技术特征摘要】
1.一种源自海洋的多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)GY40菌株，其特征在于，其保藏号为：CGMCCNO.14481。2.权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌GY40菌株的产芽孢发酵培养方法，其特征在于，其步骤如下：(1)将GY40菌株接种到PDA培养基上活化24h，在无菌条件下用接种环挑取GY40菌株于装有60mL种子液培养基的250mL三角瓶中，28℃，180r/min振荡培养16h；调整菌液浓度为109个细胞/mL，作发酵用种子液；所述种子液培养基配方为：葡萄糖20g/L、马铃薯200g/L、水1L；(2)将种子液按接种量为5％-10％接种于装有发酵培养基的发酵罐进行产芽孢发酵培养，搅拌速度为150r/min，在0～12h时通气量为14m3/h，12h后通气量调整为30m3/h，发酵时间为26h，得发酵液；发酵培养基配方为：葡萄糖0.24％，豆饼粉0.96％，玉米粉1.68％，硫酸镁0.36％，初始pH7.0。3.利用权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌GY40菌株制备GY40菌粉的方法，其特征在于，其步骤如下：将多粘类芽孢杆菌GY40菌株在发酵罐中按权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：李楠，贾杰，张海军，刘慕兰，李惠，陶忠，蒋涛，丁正庭，徐全德，
申请(专利权)人：江苏耕耘化学有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32