血清IgG核心岩藻糖基化水平的检测方法技术

本发明专利技术公开一种血清IgG核心岩藻糖基化水平检测方法，该方法包括利用凝集素特异性识别血清IgG中核心岩藻糖基的步骤，不包括从生物体取样的步骤，所述血清样品是离体样品。所述的凝集素是特异性识别核心岩藻糖基的米曲霉凝集素AOL蛋白(结构域)，通过原核表达获得，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；由序列如SEQ ID NO.2所示的FleA基因片段编码。该方法结合临床抗核抗体滴度检测，在自身免疫性疾病的筛查、自身免疫性疾病的检测方向有潜在的应用价值，为可能的免疫调控干预提供了潜在的治疗手段。

Detection method of core fucoylation level in serum IgG

The present invention discloses a method for detecting the serum IgG core fucose base level, which includes the steps of identifying the core fucose base in the serum IgG by the specificity of lectin, excluding the steps from the organism sampling, and the serum samples are in vitro samples. The agglutinin is a specific identification of the core fucose base of Aspergillus oryzae lectin AOL protein (domain), obtained by prokaryotic expression, and its amino acid sequence, as shown by SEQ ID NO.1, is encoded by a FleA gene fragment shown in the sequence, such as SEQ ID NO.2. This method, combined with the detection of clinical anti nuclear antibody titer, has potential application value in the screening of autoimmune diseases and the direction of detection of autoimmune diseases. It provides potential therapeutic means for possible immunoregulation intervention.

【技术实现步骤摘要】
血清IgG核心岩藻糖基化水平的检测方法
本专利技术属于蛋白质
，涉及糖蛋白的检测，具体涉及血清IgG核心岩藻糖基化的检测。
技术介绍
自身免疫性疾病(autoimmunediseases)是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。具有以下几个特点：1)患者有明显的家族倾向性；2)血液中存在高滴度自身抗体；3)自身免疫病常呈现反复发作和慢性迁延的过程；4)自身免疫病后期常伴随肝、肾、肠等重要器官的功能异常及并发症。目前尚无根治方法只能对症处理。如果能在早期发现自身免疫性疾病并监测其发展变化、及时治疗，可以延缓并发症的发生。目前，自身免疫性疾病的筛查手段主要检测抗核抗体(ANA)、类风湿因子(RF)、抗双链DNA(ds-DNA)抗体、抗非组蛋白(ENA)多肽谱。然而，它们的敏感性和特异性普遍不高。因此，找出一种覆盖面广、敏感性高、特异性好、操作便捷的血液学方法用于自身免疫性疾病的早期筛查、预后评估、具有重要的意义。从年龄发病率看，50岁以后发病率上升明显。因此，从40岁开始针对自身免疫性疾病进行筛查，具有很大的社会意义。糖链作为一种生物信息分子，几乎参与了所有生命过程，糖链结构的改变与疾病尤其是自身免疫性疾病、肿瘤、感染等重大疾病的发生、发展紧密相关。IgG是血清中含量最多的免疫球蛋白类型(占人血清Ig的80％)，其结晶段(Fc)含有唯一的N-糖基化修饰保守位点，即Asn297糖链由于核心七糖上连接的末端糖基不同(图1)，存在着种属、组织、年龄和性别特异性。IgG糖基化与功能密切相关。连接在Asn297的糖链可维持抗体的四级结构以及Fc段的热稳定性，并通过影响IgG分子与FcRs，C1q以及FcRn的结合而分别调节IgG分子的抗体依赖细胞毒作用(ADCC)、补体依赖的细胞毒作用(CDC)以及半衰期。研究提示IgG的Fc段糖基化修饰状态与多种疾病密切相关，例如随着类风湿性关节炎的发生、发展，IgG低半乳糖基化修饰的程度增加；晚期卵巢癌病人拥有高水平不对称寡糖结构的ConA结合(高甘露糖)的IgG。糖蛋白的加工和识别过程中，N-连接糖蛋白上的核心岩藻糖基化发挥非常重要的作用。核心岩藻糖基转移酶(Fut8)是催化核心岩藻糖基化修饰的唯一的糖基转移酶(图2)。核心岩藻糖出现在N-连接聚糖的不同阶段，并且能影响N-连接2天线寡糖的构象和适应性。我们先前的研究发现，转录生长因子β1(TGFβ-1)受体和或表皮生长因子(EGF)受体上的核心岩藻糖基化缺失后，表现出显著的活化异常，归因于配体对受体亲和力的降低。还有报道，去掉IgG1-CH2区域上的核心岩藻糖后，ADCC能够增强50-100倍。总而言之，Fut8介导的核心岩藻糖基化对蛋白质翻译后加工非常重要，其调控蛋白质的构像、稳定性及功能。目前，有关文章及专利如下：1.名称：IgG核心岩藻糖基化水平检测方法及其应用；公开号：CN102175839A。主要通过LCA凝胶层析法检测IgG核心岩藻糖基化水平，并应用于诊断肝脏疾病。2.名称：用于恶性肿瘤相关筛查及评估的产品、应用及方法；公开号：CN105277718A。主要通过检测血液中免疫球蛋白G表面双天线复杂型N糖链末端半乳糖变化对恶性肿瘤进行筛查、早期诊断和预后评估等。3.名称：用于肝癌诊断的甲胎蛋白异质体分离试剂盒及其组成试剂与应用；公开号：CN102879567A。一种用于肝癌诊断的甲胎蛋白异质体分离试剂盒。
技术实现思路
本专利技术属于蛋白质与糖学
，涉及糖蛋白的检测，具体涉及血清IgG核心岩藻糖基化水平检测在自身免疫病诊断中的应用，包括IgG核心岩藻糖基化水平检测。该方法结合临床抗核抗体滴度检测，在自身免疫性疾病的筛查中有很好的应用前景。1.本专利技术的目的是提供一种血清IgG核心岩藻糖基化水平检测方法，该方法在自身免疫性疾病的检测方向有潜在的应用价值，如：患者血清IgG核心岩藻糖基化水平的检测，为可能的免疫调控干预提供了潜在的治疗手段。该方法包括利用凝集素特异性识别血清IgG中核心岩藻糖基的步骤，该方法不包括检测血清样品的感染性；且所述方法不包括从生物体取样的步骤，所述血清样品是离体样品。该方法不包括检测血清样品的除IgG外的其他分子。由于本专利技术所选择使用的ProteinG(Acrobiosystems，RPG-S3140)和AOL均为原核表达所获得，ProteinG和AOL没有糖基化修饰。因此，参与该检测方法的各种分子只有待检血清IgG具有核心岩藻糖基结构。优选的情况下，所述的凝集素是特异性识别核心岩藻糖基的米曲霉凝集素AOL蛋白(结构域)，通过原核表达获得。优选的情况下，所述的凝集素AOL蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；由序列如SEQIDNO.2所示的FleA基因片段编码。优选的情况下，所述的利用凝集素特异性识别血清IgG中核心岩藻糖基的方法。包括A或B的步骤：A凝集素印迹方法检测血清IgG中核心岩藻糖基化水平；B通过夹心法ELISA方法检测血清IgG样品中核心岩藻糖基化水平。优选的情况下，所述的夹心法ELISA方法检测血清IgG样品中核心岩藻糖基化的方法是，首先包被重组proteinG结构域或肺炎链球菌多肽(190-384位)、再依次孵育待检血清样品、反应biotin-AOL(生物素标记的如权利要求1所述的AOL)、HRP-avidin(辣根过氧化物酶标记的avidin)，最后加入反应底物。该系统包括夹心法ELISA的开发和酶标仪(Thermo公司)，其中酶标仪能将反应液中proteinG/IgG/biotin-AOL/avidin-HRP水平进行分析。夹心法ELISA法高效、特异，适用于临床自身免疫性疾病的筛查。优选的情况下，本专利技术所使用的重组proteinG是Acrobiosystems，RPG-S3140，实际上，特异性地和人IgG结合的蛋白均可使用，例如：肺炎链球菌多肽(190-384位)。优选的情况下，所述的凝集素印迹方法检测血清IgG中核心岩藻糖基化水平的方法是，依次加入待检血清样品SDS-PAGE电泳、转至PVDF膜、反应生物素标记的如权利要求1所述的AOL、HRP(辣根过氧化物酶)标记的avidin，最后ECL显色。优选的情况下，该方法还包括步骤：CWesternblot印迹方法检测血清中IgG的表达量；D检测血清IgG表达量与核心岩藻糖基水平比值。优选的情况下，Western印迹方法检测血清中IgG的表达量的方法包括步骤：依次加入待检血清样品SDS-PAGE电泳、转至PVDF膜、反应HRP(辣根过氧化物酶)标记的驴抗人IgG抗体，最后ECL显色。优选的情况下，所述的血清IgG核心岩藻糖基水平与IgG表达量比值的方法，该方法进一步包括计算血清IgG核心岩藻糖基水平与IgG表达量比值(AOL/IgG总量的比值)检测。这样，可以直接判断该患者是否有自身免疫性疾病的倾向。其通过ImageLab与GraphpadPrism6软件进行显著性差异数据分析。此外，可以依据本专利技术上文所述的方法，利用上文所述的凝集素，即特异性识别核心岩藻糖基的米曲霉凝集素AOL蛋白(结构域)，制备一种用于血清IgG核心岩藻糖基化水平的检测试剂盒。附图说明图1血清中IgG分子是一种核心本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测血清IgG核心岩藻糖基化水平的方法，其特征在于，该方法包括利用凝集素特异性识别血清IgG中核心岩藻糖基的步骤，所述方法不包括从生物体取样的步骤，所述血清样品是离体样品。

【技术特征摘要】
1.一种检测血清IgG核心岩藻糖基化水平的方法，其特征在于，该方法包括利用凝集素特异性识别血清IgG中核心岩藻糖基的步骤，所述方法不包括从生物体取样的步骤，所述血清样品是离体样品。2.根据权利要求1所述的检测血清IgG核心岩藻糖基化水平的方法，所述的凝集素是特异性识别核心岩藻糖基的米曲霉凝集素AOL蛋白，通过原核表达获得。3.根据权利要求2所述的检测血清IgG核心岩藻糖基化水平的方法，其特征在于，所述的凝集素AOL蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；由序列如SEQIDNO.2所示的FleA基因片段编码。4.根据权利要求3所述的检测血清IgG核心岩藻糖基化水平的方法，其特征在于，所述的利用凝集素特异性识别血清IgG中核心岩藻糖基的方法，包括A或B的步骤：A凝集素印迹方法检测血清IgG中核心岩藻糖基化水平；B通过夹心法ELISA方法检测血清IgG样品中核心岩藻糖基化水平。5.根据权利要求4所述的检测血清IgG核心岩藻糖基化水平的方法，其特征在于，所述的夹心法ELISA方法检测血清IgG样品中核心岩藻糖基化的方法是，首先包被proteinG或肺炎链球菌多肽(190-384位)、再依次孵育待检血清样品、反应生物素标记的如权利要求1所述的AOL、HRP(辣根过氧化物酶)标记的avidi...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文哲，李志，李明，梁伟，李雪滢，
申请(专利权)人：大连医科大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21