一种高效表达犬圆环病毒Cap蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了一种高效表达犬圆环病毒(CanineCV)Cap蛋白的方法，以CanineCV基因组为模板序列，设计特异性引物，通过PCR扩增出Cap蛋白的完整序列，通过在线预测Cap蛋白的核定位信号，截取Cap蛋白N端26个氨基酸的核定位信号肽，并将缺失后Cap蛋白序列连接至pET‑28a载体，获得重组质粒pET(28a)‑Cap，将重组质粒转入BL21(DE3)感受态细胞后用IPTG进行诱导表达，SDS‑PAGE分析表明重组Cap蛋白在大肠杆菌BL21中获得了正确表达，以实现对犬圆环病毒Cap蛋白高效表达的目的。本发明专利技术的方法能成功克服CanineCV Cap蛋白在大肠杆菌中不表达或者表达量极低的难题，本发明专利技术表达的蛋白具有很好的免疫原性，可以应用于流行病学诊断方法的建立及其亚单位疫苗的研究。

A method for efficiently expressing Cap protein of canine circovirus

The invention discloses a method to efficiently express the Cap protein of the canine circovirus (CanineCV). The specific primers are designed with the CanineCV genome as the template sequence. The complete sequence of the Cap protein is amplified by PCR, and the nuclear positioning signal peptide of the 26 amino acids in the Cap egg white N end is intercepted by the on-line prediction of the nuclear location signal of the Cap protein, and the nucleation signal peptide of the 26 amino acid amino acids in the Cap egg white N is intercepted. The deleted Cap protein sequence was connected to the pET 28a vector, and the recombinant plasmid pET (28a) Cap was obtained, and the recombinant plasmid was transferred into the BL21 (DE3) receptive cell to induce expression. The SDS PAGE analysis showed that the recombinant Cap protein was correctly expressed in the Escherichia coli to realize the high expression of the canine circovirus protein. Objective. The method of the present invention can successfully overcome the problem that CanineCV Cap protein is not expressed in Escherichia coli or is very low in expression. The protein expressed in the present invention has good immunogenicity, and can be applied to the establishment of the epidemiological diagnosis method and the study of subunit vaccine.

【技术实现步骤摘要】
一种高效表达犬圆环病毒Cap蛋白的方法
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种利用pET-28a表达载体高效表达犬圆环病毒(CanineCV)缺失26个核定位信号的Cap蛋白的方法。
技术介绍
犬圆环病毒(Caninecircovirus，CanineCV)属于环状病毒(Circoviridae)环状病毒属，是一种二十面体对称、没有囊膜包裹的单链环状DNA病毒。CaineCV的基因组长度为2063bp，包括两个主要的开放性阅读框，分别编码复制酶Rep蛋白和核衣壳Cap蛋白。2012年CaineCV被首次报告后，陆续在意大利、德国以及中国发现。Li等在多只患有血管损伤或组织细胞炎症的犬淋巴结和脾脏内检测到CaineCV。Decaro等报道在意大利一暴发过急性肠炎的犬繁殖舍的死亡幼犬体内检测到了CanineCV。CanineCV已被确认为是引起犬淋巴结肉芽肿和坏死性血管炎的致病因子，临床症状主要表现为呕吐、出血性腹泻等。2016年孙文超等对我国CaineCV的流行状况进行了首次调查，结果表明我国流行的CanineCV毒株与欧美流行的毒株处于两个不同的分支，目前，对CaineCV的研究尚无进展，对其致病性以及致病机理尚不明确，也没有针对该种病毒的ElISA检测试剂盒和中和抗体，给临床防控带来了很大困难。CanineCV的阅读框ORF2全长为813bp，编码由270个氨基酸组成的衣壳蛋白(Cap蛋白)。为了制备针对CaineCV的EliSA检测试剂盒，并对Cap蛋白在病毒感染中作用进行深入研究，本实验以CanineCV基因组为模板序列，设计特异性引物，通过PCR扩增出Cap蛋白的完整序列，通过在线预测Cap蛋白的核定位信号，切除了Cap蛋白N端由26个氨基酸序列组成的核定位信号肽，并将缺失后的的Cap蛋白序列连接至pET-28a载体上，通过大肠杆菌原核表达系统表达Cap蛋白，为制备Cap蛋白的抗体和亚单位疫苗奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对当前CanineCVCap蛋白完整基因表达过程中，Cap蛋白表达量低或者不表达、表达产物需要低温诱导，给后续大规模纯化带来困难，同时保留cap的反应原性和免疫原性，本专利技术的的目的是利用pET-28a表达载体高效表达CanineCV去掉核定位信号的Cap蛋白，实现Cap蛋白高效表达，并且具有良好反应原性。在本专利技术的目的主要把是通过以下技术方案实现：一种利用pET-28a表达载体高效表达CanineCVCap蛋白的方法，其步骤包括：(1)以CanineCV基因组为模板序列，设计特异性引物，PCR扩增实现CanineCV去核定位信号肽的Cap蛋白序列；(2)将步骤(1)扩增获得的基因片段，连接到pET-28a载体中，构建重组质粒pET(28a)-Cap。(3)将步骤(2)获得的重组质粒转化大肠杆菌BL21，然后利用IPTG进行诱导表达得到融合Cap蛋白步骤(1)所述的特异性引物序列为：d(1-26)capF：5’-GCGGGATCCAAGCTCAGGTTGA-3’d(1-26)capR：5’-CCCTCGAGGTAGTTATACATGAAAGGGAAC-3’步骤(2)将所述的步骤(1)Cap蛋白序列插入到pET-28a载体BamHI和XhoI。步骤(3)可以在37℃条件下利用IPTG可以实现快速表达。本专利技术的原理是:犬圆环病毒Cap蛋白经NLStradamus网站预测，CanineCV的Cap蛋白N端的第2个至第26个氨基酸组成其核定位信号，这表明CanineCV的Cap蛋白可以进入宿主细胞的细胞核，而其主要抗原抗原位点得到保留。本专利技术通过去掉核定位信号实现Cap蛋白的高效表达在大肠杆菌中表达，。pET-28a表达载体利用其自身的较强的启动子、标签序列，可以实现后期利用标签大量纯化。本专利技术一种利用pET-28a表达载体高效表达CanineCVCap蛋白的方法，具有以下优点：(1)本专利技术的方法能成功克服CanineCVCap蛋白在大肠杆菌不表达或者表达量很少的难题；(2)本专利技术在37℃条件利用IPTG诱导就可以实现蛋白表达；(3)本专利技术CanineCVCap蛋白为融合蛋白包含His标签方便后期纯化。(4)本专利技术Westernblotting分析结果表明，本专利技术CanineCVCap蛋白具有很好的反应原性和免疫原性，可以为后期流行病学诊断方法建立及其亚单位疫苗的应用。附图说明图1为本专利技术Cap基因的PCR扩增。图2为本专利技术pET(28a)-Cap质粒双酶切鉴定。图3为本专利技术重组蛋白表达形式分析。M:蛋白Marker1:pET-28a诱导前产物2:pET-28a诱导后产物3:重组菌诱导产物沉淀4:重组菌诱导产物上清图4为本专利技术重组蛋白表达Western-blot鉴定M:蛋白Marker1:pET-28a诱导前产物2:pET-28a诱导后产物3:重组菌诱导前产物4:重组菌诱导后产物具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步详细的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围，其他的任何未背离本专利技术的原理下所做的修饰、改变、组合替代等置换方式，都包含在本专利技术保护范围之内。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件。实施例1一种高效表达犬圆环病毒Cap蛋白的方法，包括以下步骤：一、重组质粒pET(28a)-Cap的构建1、CanineCV基因组的提取取阳性CanineCV血清，参照天根基因组参照血液/组织/细胞基因组提取试剂盒说明书提取病毒基因组。2、针对犬圆环病毒Cap蛋白基因设计特异性引物：d(1-26)capF：5’-GCGGGATCCAAGCTCAGGTTGA-3’d(1-26)capR：5’-CCCTCGAGGTAGTTATACATGAAAGGGAAC-3’上游引物包含BamHI酶切位点和下游引物包含XhoI酶切位点，上下游均由吉林库美生物公司合成。3、PCR扩增PCR反应体系总体积为25μL：1μLDNA，22μL金牌Mix，1μL上下游引物(10μM)：反应条件为：98℃预变性5min，35个循环变性；98℃10s，57℃15s，72℃45s；72℃5min。1％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，回收纯化后连入pET(28a)载体4、原核表达载体的构建将测序正确的片段及pET-28a载体分别经XhoI和BamHI双酶切，电泳鉴定后回收酶切产物，16℃连接6h，连接产物转化感受态Tran5α，菌液涂布在含有卡那霉素的LB平板上培养14小时。取单菌落至含卡那霉素的LB液体培养基中培养12h，小提质粒后双酶切鉴定，阳性质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，将测序正确的质粒命名为pET(28a)-d(1-26)Cap。二、Cap融合蛋白诱导表达将pET(28a)-Cap或pET(28a)-d(1-26)Cap质粒转化BL21感受态细胞后，涂布在含有卡那霉素的LB平板上培养12h。从平板上挑取单菌落至含有卡那霉素的LB液体培养基中培养12h，将母液按1:300的比例接种到2YT培养液中，将菌液培养至OD600值至0.6左右，加入终浓度为1mM的IPTG，取时间点收取样品SDS-PAGE电泳后，凝胶通过半干转膜仪将蛋白转移至PVDF本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效表达犬圆环病毒Cap蛋白，其特征包括以下步骤：(1)以CanineCV基因组为模板序列，设计特异性引物，PCR扩增实现CanineCV去核定位信号肽的Cap蛋白序列；(2)将步骤(1)扩增获得的基因片段，连接到pET‑28a载体中，构建重组质粒pET(28a)‑Cap。(3)将步骤(2)获得的重组质粒转化大肠杆菌BL21，然后利用IPTG进行诱导表达得到融合Cap蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种高效表达犬圆环病毒Cap蛋白，其特征包括以下步骤：(1)以CanineCV基因组为模板序列，设计特异性引物，PCR扩增实现CanineCV去核定位信号肽的Cap蛋白序列；(2)将步骤(1)扩增获得的基因片段，连接到pET-28a载体中，构建重组质粒pET(28a)-Cap。(3)将步骤(2)获得的重组质粒转化大肠杆菌BL21，然后利用IPTG进行诱导表达得到融合Cap蛋白。2.根据权利要求1所述的一种高效表达犬圆环病毒Cap蛋白，其特征在于步骤(1)所述的特异性...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙文超，赵翠青，鲁会军，李霄，金宁一，田明尧，汪伟，曹亮，
申请(专利权)人：温州大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33