缢蛏溶菌酶基因、编码蛋白及重组缢蛏溶菌酶基因工程菌的构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了缢蛏溶菌酶基因、编码蛋白及重组缢蛏溶菌酶基因工程菌构建方法和应用，特点是缢蛏溶菌酶基因序列如SEQIDNO.1所示；缢蛏溶菌酶基因编码蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；其重组缢蛏溶菌酶基因工程菌构建方法为用分别含有BamHI位点和XhoI位点的引物扩增缢蛏溶菌酶基因编码蛋白的成熟肽序列；将克隆得到的目的基因插入pET28a（+）载体，获得重组质粒pET28a（+）‑Lysozyme；对重组质粒pET28a（+）‑Lysozyme进行诱导表达，获得重组缢蛏溶菌酶基因工程菌，优点是其表达的重组缢蛏溶菌酶基因工程菌对哈维氏弧菌，副溶血弧菌，灿烂弧菌均具有明显的杀菌作用。

Construction method and application of lysozyme gene, encoded protein and recombinant strain of razor clam lysozyme in constricted razor clam

The invention discloses the construction method and application of the lysozyme gene, the encoded protein and the recombinant strain of the recombinant clam clam lysozyme, characterized by the sequence of the clam clam lysozyme gene, as shown by SEQIDNO.1, the sequence of the amino acid sequence of the lysozyme gene encoding protein of the razor clam, as shown by SEQIDNO.2, and the construction method of the recombinant strain of the recombinant clam clam lysozyme gene. The mature peptide sequence was amplified by the primers containing BamHI loci and XhoI loci respectively. The recombinant plasmid pET28a (+) Lysozyme was inserted into the pET28a (+) vector, and the recombinant plasmid pET28a (+) Lysozyme was induced and expressed in the recombinant plasmid pET28a (+) Lysozyme, and the recombinant clam lysozyme was obtained. The advantage of the gene engineering bacteria is that the recombinant recombinant clam clam lysozyme gene engineering bacteria have obvious bactericidal effect on Vibrio Vibrio, Vibrio parahaemolyticus and Vibrio radivibrio.

【技术实现步骤摘要】
缢蛏溶菌酶基因、编码蛋白及重组缢蛏溶菌酶基因工程菌的构建方法和应用
本专利技术属于分子生物学以及基因工程
，尤其是涉及一种缢蛏溶菌酶基因、编码蛋白及重组缢蛏溶菌酶基因工程菌的构建方法和应用。
技术介绍
溶菌酶（Lysozyme，EC3.2.1.17）是一种具有水解粘多糖功能的碱性酶，它能催化细菌细胞壁中粘多糖N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4糖苷键的水解，进而破坏细菌细胞壁肽聚糖支架、导致内容物逸出，从而引起细菌死亡。溶菌酶作为一种广谱抗菌效应分子，广泛存在于各种微生物、植物、无脊椎动物和脊椎动物中，并在生物机体的免疫防御系统中发挥重要作用。在无脊椎动物组织中分布最为广泛的抗菌蛋白即是溶菌酶，这对只有先天免疫的无脊椎动物而言，溶菌酶的抗菌效应更为重要。在无脊椎动物中，溶菌酶还具有消化酶的作用，其通过分解微生物来获得生长所需的部分碳源和氮源。随着研究的深入，研究者发现溶菌酶除抗菌活性外，还具有许多其它功能，包括抗病毒、抗炎、抗肿瘤活性，以及诱导调节机体其他免疫因子的合成与分泌、协同其它免疫因子进行免疫防御调节作用。溶菌酶独特的作用机制和广泛的抗菌作用，使其在临床研究及大规模的市场应用上受到了越来越广泛的关注。在医学上，溶菌酶可以作为多种疾病的标志物，通过测定尿液、分泌物、血清或组织中溶菌酶的浓度和活性变化，作为诊断的指标之一。根据溶菌酶能溶菌，但对组织无刺激、无毒性的特性，己广泛应用于食品、医药、化工、生物工程等领域。目前，人们对动物性食品安全的要求越来越高，溶菌酶作为天然、安全的抗菌物质也越来越广泛的应用于畜禽及水产动物饲料中。随着对水产动物免疫抗病机制研究的不断深入，将重组溶菌酶作为绿色制剂应用到水产养殖中有望成为水产动物健康养殖的一条新途径。缢蛏（Sinonovaculaconstricta）作为我国四大养殖贝类之一，在水产养殖中占据了重要的经济地位。然而，随着沿海城市经济的发展，海洋污染日益加剧，导致养殖缢蛏病害问题时有发生，尤其是细菌性疾病引发的疾病严重制约了缢蛏的生存和生长。目前在缢蛏养殖中大多使用抗生素进行防治，但抗生素的大量使用导致了“超级细菌”的出现以及抗生素的残留引起的食品安全问题日益突出，人们迫切需要开发新型抗菌剂进行防治。溶菌酶作为一种天然杀菌蛋白，不会导致细菌耐药性问题、而且对人体无毒害作用。因此，构建缢蛏溶菌酶基因表达工程菌，进而产业化制备绿色疾病制剂应用于水产养殖迫在眉睫。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种缢蛏溶菌酶基因、编码蛋白及重组缢蛏溶菌酶基因工程菌的构建方法和应用，其表达的重组缢蛏溶菌酶基因工程菌对哈维氏弧菌，副溶血弧菌，灿烂弧菌均具有明显的杀菌作用。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：1、一种缢蛏溶菌酶基因，该基因具有SEQIDNO.1所示的cDNA序列。该序列全长768bp，包括423bp的开放阅读框，编码140个氨基酸，5’非编码区长168bp，3’非编码区长177bp，具有多聚腺苷酸信号(AATAAA)及序列末端含有典型的polyA尾。所述的缢蛏溶菌酶基因的克隆方法，具体步骤如下：a．总RNA提取：取缢蛏鳃组织制备得到RNA提取液；b．cDNA第一链合成：将RNA提取液用cDNA合成试剂盒逆转录合成cDNA；c．PCR扩增：cDNA1.0μL，含Mg2+的10×PCR缓冲液2.5μL，浓度2.5mM的dNTP2.0μL，浓度10μM的Lysozyme上游扩增引物1.0μL，浓度10μM的Lysozyme下游扩增引物1.0μL，浓度5U/μL的DNA聚合酶0.2μL，超纯水17.3μL；扩增条件：94℃5min、94℃30s、60℃30s、72℃1min，共35个循环，最后72℃延伸10min；其中Lysozyme上游扩增引物：ATGCTCCTTTACGCTGTGGTCAT，Lysozyme下游扩增引物：CTAATGGACATTAGAACATCCTG；d.PCR阳性克隆质粒：扩增反应后，用胶回收试剂盒回收PCR产物，然后回收产物与载体pMD19-T连接，转化至大肠杆菌EscherichiacoliDH5α后，在含有氨苄浓度为50μg/mL的LB平板培养基中培养8-12h，挑取阳性克隆菌落，进行PCR验证，并送至上海生工生物工程有限公司测序鉴定，得到正确的PCR阳性克隆质粒，即缢蛏溶菌酶基因，该基因具有SEQIDNO.1所示的cDNA序列。2、缢蛏溶菌酶基因编码蛋白，该编码蛋白具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。该蛋白分子量为15.204KDa，等电点为6.47，其中编码序列的1-18位为信号肽序列，2-24位为跨膜区，19-140位为成熟肽。该编码蛋白的成熟肽具有SEQIDNO.3所示的氨基酸序列。3、一种利用上述缢蛏溶菌酶基因编码蛋白构建重组缢蛏溶菌酶基因工程菌的方法，步骤如下：（1）设计PCR引物，用分别含有BamHI位点和XhoI位点的引物扩增缢蛏溶菌酶基因编码蛋白的成熟肽序列；（2）将克隆得到的目的基因插入pET28a（+）载体，获得重组质粒pET28a（+）-Lysozyme；（3）对重组质粒pET28a（+）-Lysozyme进行诱导表达，获得重组缢蛏溶菌酶基因工程菌。具体步骤如下：（1）PCR扩增：取缢蛏鳃组织制备得到RNA提取液，将RNA提取液用cDNA合成试剂盒逆转录合成cDNA；然后以合成的cDNA为模板，用分别含有BamHI位点和XhoI位点的引物PCR扩增缢蛏溶菌酶编码蛋白的成熟肽序列，其中含BamHI位点Lysozyme上游扩增引物的基因序列如下所示：GGATCCTTTGCGACCGGCATGGTCTCTCA；含XhoI位点Lysozyme下游扩增引物的基因序列如下所示：CTCGAGCTAATGGACATTAGAACATCCTG；（2）PCR阳性克隆质粒：扩增反应后，用胶回收试剂盒回收PCR产物，然后回收产物与载体pMD19-T连接，转化至大肠杆菌E.coliDH5α后，在含有氨苄浓度为50μg/mL的LB平板培养基中培养8-12h，挑取阳性克隆菌落，进行PCR验证和测序鉴定，得到正确的PCR阳性克隆质粒；（3）重组质粒：将PCR阳性克隆质粒用BmHI和XhoI限制性内切酶双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收分子量在423bp的目的条带，与经同样酶切的pET28（a）原核表达载体酶切产物连接，转化E.coliDH5α，PCR筛选阳性克隆，经测序鉴定获得编码框正确的表达载体pET28（a）-Lysozyme重组质粒；（4）重组蛋白的表达：利用质粒提取试剂盒纯化阳性菌株重组质粒pET28（a）-Lysozyme，转化到表达宿主E.colirosetta，再接种到卡那霉素浓度为50μg/mL的LB培养液中，37℃、200r/min振荡培养至菌液OD600的值为0.4-0.6时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷使其终浓度为1mmol/L，37℃诱导表达3-6h，收集菌液，经12000r/min离心5min，弃上清液，得到细菌沉淀物即重组缢蛏溶菌酶基因工程菌。4、上述重组缢蛏溶菌酶基因工程菌的纯化与复性，具体步骤如下：（1）菌体裂解与蛋白纯化：将每100mL细菌沉淀物用10mL包涵体洗涤液重悬，超本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种缢蛏溶菌酶基因，其特征在于该基因具有SEQIDNO.1所示的cDNA序列。

【技术特征摘要】
1.一种缢蛏溶菌酶基因，其特征在于该基因具有SEQIDNO.1所示的cDNA序列。2.一种权利要求1所述的缢蛏溶菌酶基因的克隆方法，其特征在于具体步骤如下：a．总RNA提取：取缢蛏鳃组织制备得到RNA提取液；b．cDNA第一链合成：将RNA提取液用cDNA合成试剂盒逆转录合成cDNA；c．PCR扩增：cDNA1.0μL，含Mg2+的10×PCR缓冲液2.5μL，浓度2.5mM的dNTP2.0μL，浓度10μM的Lysozyme上游扩增引物1.0μL，浓度10μM的Lysozyme下游扩增引物1.0μL，浓度5U/μL的DNA聚合酶0.2μL，超纯水17.3μL；扩增条件：94℃5min、94℃30s、60℃30s、72℃1min，共35个循环，最后72℃延伸10min；其中Lysozyme上游扩增引物：ATGCTCCTTTACGCTGTGGTCAT，Lysozyme下游扩增引物：CTAATGGACATTAGAACATCCTG；d.PCR阳性克隆质粒：扩增反应后，用胶回收试剂盒回收PCR产物，然后回收产物与载体pMD19-T连接，转化至大肠杆菌EscherichiacoliDH5α后，在含有氨苄浓度为50μg/mL的LB平板培养基中培养8-12h，挑取阳性克隆菌落，进行PCR验证，并送至上海生工生物工程有限公司测序鉴定，得到正确的PCR阳性克隆质粒，即缢蛏溶菌酶基因，该基因具有SEQIDNO.1所示的cDNA序列。3.一种根据权利要求1所述的缢蛏溶菌酶基因编码蛋白，其特征在于：该编码蛋白具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。4.根据权利要求3所述的缢蛏溶菌酶基因编码蛋白，其特征在于：该编码蛋白的成熟肽具有SEQIDNO.3所示的氨基酸序列。5.一种利用权利要求4所述的缢蛏溶菌酶基因编码蛋白构建重组缢蛏溶菌酶基因工程菌的方法，其特征在于步骤如下：（1）设计PCR引物，用分别含有BamHI位点和XhoI位点的引物扩增缢蛏溶菌酶基因编码蛋白的成熟肽序列；（2）将克隆得到的目的基因插入pET28a（+）载体，获得重组质粒pET28a（+）-Lysozyme；（3）对重组质粒pET28a（+）-Lysozyme进行诱导表达，获得重组缢蛏溶菌酶基因工程菌。6.根据权利要求5所述的重组缢蛏溶菌酶基因工程菌的构建方法，其特征在于具体步骤如下：（1）PCR扩增：取缢蛏鳃组织制备得到RNA提取液，将RNA提取液用cDNA合成试剂盒逆转录合成cDNA；然后以合成的cDNA为模板，用分别含有BamHI位点和XhoI位点的引物PCR扩增缢蛏溶菌酶编码蛋白的成熟肽序列，其中含BamHI位点Lysozyme上游扩增引物的基因序列如下所示：GGATCCTTTGCGACCGGCATGGTCTCTCA；含XhoI位点Lysozyme下游扩增引物的基因序列如下所示：CTCGAGCTAATGGACATTAGAACATCCTG；（2）PCR阳性克隆质粒：扩增反应后，用胶回收试剂盒回收PCR产物，然后回收产物与载体pMD19-T连接，转化至大肠杆菌E.coliDH5α后，在含有氨苄浓度为50μg/mL的LB平板培养基中培养8-12h，挑取阳性克隆菌落，进行PCR验证和测序鉴定，得到正确的PCR阳性克隆质粒；（3）重组质粒：将PCR阳性克隆质粒用BmHI和XhoI限制性内切酶双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收分子量在423bp的目的条带，与经同样酶切的pET28（a）原核表达载体酶切产物连接，转化E.coliDH5α，PCR筛选阳性克隆，经测序鉴定获得编码框正确的表达载体pET28（a）...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵铱娜，李成华，魏智薪，张卫卫，赵雪琳，蒋丽婷，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33