将单个核细胞复苏并诱导为多种细胞因子诱导的杀伤细胞的方法技术

本发明专利技术公开了将单个核细胞复苏并诱导为多种细胞因子诱导的杀伤细胞的方法。该方法包括：将冷冻保存的单个核细胞置于37‑42℃水浴中融化，以便得到融化的单个核细胞；将所述融化的单个核细胞与用于多种细胞因子诱导的杀伤细胞的冷冻复苏液混合，以便得到复苏细胞混合液，其中，所述冷冻复苏液包含白蛋白和右旋糖酐；将所述复苏细胞混合液进行离心处理，以便得到复苏细胞；以及将所述复苏细胞进行定向诱导处理，以便得到诱导后的多种细胞因子诱导的杀伤细胞。该方法复苏得到的单个核细胞，在后续的诱导、扩增过程中，获得的多种细胞因子诱导的杀伤细胞增殖速率快，诱导分化效率高，细胞活性好。

A method for recovering and inducing single nuclear cells into cytokine induced killer cells

The invention discloses a method for recovering mononuclear cells and inducing them into cytokine induced killer cells. The method includes the melting of frozen preserved mononuclear cells in a water bath of 37, 42 degrees centigrade to obtain melted mononuclear cells; the melted mononuclear cells are mixed with the cryopreservation fluid used for a variety of cytokine induced killer cells to obtain a resuscitation cell mixture, in which the frozen resuscitation fluid is described. Inclusion of albumin and dextran; centrifuging the mixture of the resuscitation cells to obtain the resuscitation cells, and the directed induction treatment of the resuscitation cells to obtain the induced cytokine induced killer cells. In the process of subsequent induction and amplification of mononuclear cells obtained by this method, the proliferation rate of cytokine induced by a variety of cytokines is fast, the induced differentiation efficiency is high, and the cell activity is good.

【技术实现步骤摘要】
将单个核细胞复苏并诱导为多种细胞因子诱导的杀伤细胞的方法
本专利技术涉及生物工程领域，具体地，将单个核细胞复苏并诱导扩增为多种细胞因子诱导的杀伤细胞的方法。
技术介绍
多种细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-inducedkiller，CIK)，为人血液中的单个核细胞在体外经多种细胞因子诱导、扩增获得的一群异质细胞。该细胞同时表达CD3+和CD56+两种细胞膜表面标志，故称为NK细胞样T淋巴细胞，具有T淋巴细胞活性和NK细胞的非MHC限制性。因此，可用于激活机体免疫系统，提高机体的免疫力；CIK细胞能够分泌IL-2、IL-6、IFN-γ等多种细胞因子，对白血病、淋巴瘤、肺癌、胃癌、肠癌治疗，防止肿瘤复发与转移，提高患者生活质量发挥了重要作用。CIK细胞中的效应细胞CD3+CD56+细胞在正常人外周血中少见，仅1％—5％，数量少。为了获得更多的CIK细胞，并满足择期应用的需求，将正常人外周血或脐血等中单个核细胞冷冻保存，需要时进行复苏并诱导、扩增，可获得大量的CIK细胞。复苏冷冻保存的细胞，常使用含胎牛血清的培养基作为复苏液。由于胎牛血清为动物来源，不适于细胞产品的临床应用。因此，摸索一种有利于CIK细胞诱导、扩增的方法，成为目前亟待解决的问题
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种将单个核细胞复苏并诱导为多种细胞因子诱导的杀伤细胞的方法，利用包含白蛋白和右旋糖酐冷冻复苏液复苏的单个核细胞，诱导、扩增形成多种细胞因子诱导的杀伤细胞的增殖速率快，诱导分化效率高，细胞活性好。根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种将单个核细胞复苏并诱导为多种细胞因子诱导的杀伤细胞的方法。根据本专利技术的实施例，该方法包括：将冷冻保存的单个核细胞置于37-42℃水浴中融化，以便得到融化的单个核细胞；将所述融化的单个核细胞与用于多种细胞因子诱导的杀伤细胞的冷冻复苏液混合，以便得到复苏细胞混合液，其中，所述冷冻复苏液包含白蛋白和右旋糖酐；将所述复苏细胞混合液进行离心处理，以便得到复苏细胞；以及将所述复苏细胞进行定向诱导处理，以便得到诱导后的多种细胞因子诱导的杀伤细胞。根据本专利技术的实施例的将单个核细胞复苏并诱导为多种细胞因子诱导的杀伤细胞的方法，采用含有白蛋白和右旋糖酐的冷冻复苏液复苏得到的单个核细胞，在后续的诱导过程中，诱导形成多种细胞因子诱导的杀伤细胞的增殖速率快，诱导分化效率高，细胞活性好。另外，根据本专利技术上述实施例的冷冻复苏液还可以具有如下附加的技术特征：根据本专利技术的实施例，所述白蛋白为人白蛋白。根据本专利技术的实施例，所述人白蛋白来源于市售人血清白蛋白或自体血浆。根据本专利技术的实施例，所述白蛋白的含量为1-5％。根据本专利技术的优选实施例，所述白蛋白的含量为2.5％。根据本专利技术的实施例，所述右旋糖酐为右旋糖酐40。根据本专利技术的实施例，所述右旋糖酐的含量为2-8重量％。根据本专利技术的优选实施例，所述右旋糖酐的含量为5重量％。根据本专利技术的实施例，所述融化的单个核细胞与所述冷冻复苏液混合的体积比为1：0.5-5。根据本专利技术的优选实施例，所述融化的单个核细胞与所述冷冻复苏液混合的体积比为1：1。根据本专利技术的实施例，利用诱导因子进行所述定向诱导处理，所述诱导因子包括：干扰素γ和细胞培养添加物。根据本专利技术的一些实施例，该细胞培养添加物可以为supgrow。根据本专利技术的实施例，干扰素γ的浓度为700-1300U/ml。根据本专利技术的优选实施例，干扰素γ的浓度为1000U/ml。根据本专利技术的实施例，细胞培养添加物的浓度为1-5体积％。根据本专利技术的优选实施例，细胞培养添加物的浓度为2.5体积％。本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。附图说明本专利技术的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：图1显示了根据本专利技术一个实施例的将单个核细胞复苏并诱导为多种细胞因子诱导的杀伤细胞的方法的流程示意图；图2显示了根据本专利技术一个实施例的复苏液对诱导CIK细胞增殖的影响；图3显示了根据本专利技术一个实施例的流式细胞仪检测经体外诱导17天的P组的细胞表面标志表达情况示意图；图4显示了根据本专利技术一个实施例的流式细胞仪检测经体外诱导17天的F1组的细胞表面标志表达情况示意图；图5显示了根据本专利技术一个实施例的复苏液对诱导CIK细胞增殖的影响；图6显示了根据本专利技术一个实施例的流式细胞仪检测经体外诱导14天的P组的细胞表面标志表达情况示意图；图7显示了根据本专利技术一个实施例的流式细胞仪检测经体外诱导14天的F1组的细胞表面标志表达情况示意图；图8显示了根据本专利技术一个实施例的流式细胞仪检测经体外诱导14天的F2组的细胞表面标志表达情况示意图；图9显示了根据本专利技术一个实施例的流式细胞仪检测经体外诱导14天的F3组的细胞表面标志表达情况示意图；图10显示了根据本专利技术一个实施例的流式细胞仪检测经体外诱导18天的P组的细胞表面标志表达情况示意图；图11显示了根据本专利技术一个实施例的流式细胞仪检测经体外诱导18天的F1组的细胞表面标志表达情况示意图；图12显示了根据本专利技术一个实施例的流式细胞仪检测经体外诱导18天的F2组的细胞表面标志表达情况示意图；图13显示了根据本专利技术一个实施例的流式细胞仪检测经体外诱导18天的F3组的细胞表面标志表达情况示意图。具体实施方式下面详细描述本专利技术的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。根据本专利技术的又一方面，本专利技术提供了一种将单个核细胞复苏并诱导为多种细胞因子诱导的杀伤细胞的方法。参考图1，根据本专利技术的实施例，该方法包括：S100水浴融化根据本专利技术的实施例，将冷冻的单个核细胞置于37-42℃水浴中融化，得到融化的单个核细胞。由此，利用水浴使细胞外结晶快速融化，以避免慢速融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。S200复苏处理根据本专利技术的实施例，将融化的单个核细胞与用于多种细胞因子诱导的杀伤细胞的冷冻复苏液混合，得到复苏细胞混合液，其中，该冷冻复苏液包括白蛋白和右旋糖酐。由此，利用包括白蛋白和右旋糖酐的冷冻复苏液稀释融化的单个核细胞，在常温下，不仅减少在细胞冻存液中的DMSO对单个核细胞的伤害，而且冷冻复苏液中的白蛋白和右旋糖酐对融化的单个核细胞渗透压和营养起调节作用。根据本专利技术的实施例，该白蛋白为人白蛋白。血液中的白蛋白具有运输、维持渗透压以及营养作用。体外白蛋白具有保护细胞的作用。而人白蛋白与单个核细胞均为血液成分，更有利于保护细胞，使细胞的活力更好，促进单个核细胞诱导为CIK细胞，并且得到CIK细胞用于临床，患者的排异作用小。根据本专利技术的实施例，人白蛋白的来源不受特别的限制，只要能提供人白蛋白即可，即可以来源于市售人血清白蛋白，也可以来源于人体血浆。人单个核细胞对人源性的人血清白蛋白或血浆的排异作用小，有利于冻存细胞的恢复。根据本专利技术的实施例，白蛋白的含量不受特别的限制，只要能提高单个核细胞诱导为CIK细胞的诱导效率、扩增倍数或活性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种将单个核细胞复苏并诱导为多种细胞因子诱导的杀伤细胞的方法，其特征在于，包括：将冷冻保存的单个核细胞置于37‑42℃水浴中融化，以便得到融化的单个核细胞；将所述融化的单个核细胞与用于多种细胞因子诱导的杀伤细胞的冷冻复苏液混合，以便得到复苏细胞混合液，其中，所述冷冻复苏液包含白蛋白和右旋糖酐；将所述复苏细胞混合液进行离心处理，以便得到复苏细胞；以及将所述复苏细胞进行定向诱导处理，以便得到诱导后的多种细胞因子诱导的杀伤细胞。

【技术特征摘要】
1.一种将单个核细胞复苏并诱导为多种细胞因子诱导的杀伤细胞的方法，其特征在于，包括：将冷冻保存的单个核细胞置于37-42℃水浴中融化，以便得到融化的单个核细胞；将所述融化的单个核细胞与用于多种细胞因子诱导的杀伤细胞的冷冻复苏液混合，以便得到复苏细胞混合液，其中，所述冷冻复苏液包含白蛋白和右旋糖酐；将所述复苏细胞混合液进行离心处理，以便得到复苏细胞；以及将所述复苏细胞进行定向诱导处理，以便得到诱导后的多种细胞因子诱导的杀伤细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述白蛋白为人白蛋白。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述人白蛋白来源于市售人血清白蛋白或自体血浆。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述白蛋白的含量为1-5％，优...

【专利技术属性】
技术研发人员：裴雪涛，陈琳，陈海明，岳文，姚海雷，习佳飞，何丽娟，张博文，贾雅丽，南雪，谢小燕，
申请(专利权)人：华南生物医药研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44