一种通过盐胁迫促进罗汉果悬浮细胞生长及提升甜苷V含量的方法技术

本发明专利技术涉及一种通过盐胁迫促进罗汉果悬浮细胞生长及提升甜苷V含量的方法，其特征在于，在以初代罗汉果悬浮细胞体系培养成熟罗汉果悬浮细胞过程中控制钾离子浓度为100～2000mg/kg，钾钠离子浓度比为5～20:1。本发明专利技术方法提高罗汉果生长量、比生长速率和罗汉果甜甙v的产量以及合成速率，利于罗汉果悬浮细胞生长和罗汉果甜甙v的市场化大规模生产；同时有效地缩短了细胞的生产培养周期，以人工方式调节罗汉果悬浮细胞生物量和罗汉果甜苷V的生产过程，有利于产品的质量控制管理。

A method to promote the growth and enhance the content of sweet glucoside V in Momordica Grosvenor suspension cells by salt stress

The invention relates to a method of promoting the growth and upgrading of V content of Fructus grosvenorum suspension cells by salt stress, which is characterized by the control of potassium ion concentration from 100 to 2000mg/kg in the process of the suspension cell culture of mature grosveno suspension cell system, and the concentration ratio of potassium sodium to 5 ~ 20:1. The method improves the growth rate of Rohan fruit, the specific growth rate, the yield and the synthesis rate of V, which is beneficial to the growth of the suspension cells of Rohan fruit and the large-scale production of the ropenoside V, and the production and culture cycle of the cells can be shortened effectively. The production process of V is beneficial to the quality control and management of products.

【技术实现步骤摘要】
一种通过盐胁迫促进罗汉果悬浮细胞生长及提升甜苷V含量的方法
本专利技术涉及生物
，特别是一种通过盐胁迫促进罗汉果悬浮细胞生长及提升甜苷V含量的方法。
技术介绍
罗汉果甜甙Ⅴ，又称罗汉果甜苷，是葫芦科罗汉果属罗汉果的主要甜味成分，其甜度是蔗糖的350倍，目前已鉴定出七种单体成分，其中以罗汉果甜甙Ⅴ及赛门苷Ⅰ的甜度最强。罗汉果甜甙Ⅴ具有清热润肺，利咽开音，润肠通便等药用功效；同时，罗汉果甜甙Ⅴ还具有味道新颖、口味纯正等特点，从而使其深受人们的喜爱，是肥胖症、高血压、糖尿病患者等特殊人群最适宜的甜味剂和保健品，具有广泛的应用价值。目前，获取罗汉果甜甙Ⅴ的方法主要是以天然罗汉果为原料，并通过加热等方法提取制备而成。但是，天然罗汉果中的固有罗汉果甜甙Ⅴ成分极低，现有技术对于罗汉果的利用率以及罗汉果甜甙Ⅴ的提取率并不高，造成了极大的原料浪费，同时也不能满足日益增长的市场需求。植物细胞悬浮培养是指植物的一部分组织在离体的条件下，经激素诱导控制形成愈伤组织或其他易于分散的组织，再经其接种到液体培养基中，培养后形成均一液体悬浮培养体系的一种技术。因为细胞的全能性，所以原则上可以采用植物的任何部分外植体，在适当的培养基上进行愈伤组织的诱导进而形成悬浮培养体系，这也是植物悬浮培养体系建立的最主要方式。目前获取罗汉果甜甙Ⅴ的方法主要是以天然罗汉果为原料，并通过加热等方法提取制备而成，这些天然产物绝大部分属于植物的次生代谢产物，在植物体内一般含量较低，直接从植物中提取不但占用大片的耕地，而且还可能造成一些珍贵稀有植物种类的灭绝。通过植物细胞培养技术生产目的次级代谢产物，是提高天然植物中目标成分含量的有效手段之一。近年来受到广泛关注，细胞培养正逐步替代这些植物的传统农业种植方式，缓解工业中次生代谢物的生产压力。细胞悬浮培养具有繁殖速度快、培养规模大和提供大量均匀一致植物细胞培养物的特点。盐胁迫通常会对植物造成离子失衡、氧化胁迫与渗透胁迫等伤害，盐浓度过高甚至会导致植物死亡。在适应盐胁迫过程中，植物逐渐进化出离子选择性吸收/外排、Na+区室化、利用抗氧化系统解毒，以及积累渗透保护物质等一系列代谢机制和网络调控体系。植物悬浮细胞应对盐胁迫，对Na+的选择性吸收/外排和区室化对植物响应盐胁迫具有重要作用。胁迫条件下罗汉果悬浮细胞最明显的生理响应是生物量和罗汉果甜苷V，它们是细胞一系列生理和生化响应变化的最终结果，是由代谢网络的变化所带来的。而引起代谢网络变化的因素很多，可能是由于代谢竞争途径的阻断、代谢途径关键酶活的变化、代谢调控因子的调控、胞内氧化应激状态的变化、或关键基因表达变化等因素造成的。Na+是造成植物盐害及产生盐渍生境的主要离子，K+是植物生长发育所必需的大量元素和重要的渗透调节组分。然而由于这两种离子的半径和水合能相似，Na+对K+吸收呈现明显的竞争性抑制作用。因此对于钾钠离子选择性吸收程度的高低是影响植物生长能力的一个重要因素。国内外在树木对盐分的生理生化、分子生物学响应机制方面做了大量研究，但目前尚无关于盐胁迫和钾钠比对罗汉果悬浮细胞方面的报告。因此，有必要对罗汉果悬浮细胞在不同比例的钾钠比条件下其生长、罗汉果甜苷合成、金属离子以及有机酸变化情况等进行评价和比较，以期为后续放大培养和产物合成的应用提供参考。
技术实现思路
本专利技术的目的是寻找一种合适的钾钠比浓度，从而促进罗汉果悬浮细胞生长及甜苷V积累。所述方法不仅有效地缩短了细胞的生产培养周期，还提高了罗汉果悬浮细胞的生物量，同时促进罗汉果悬浮细胞中罗汉果甜苷V合成，明显提高生产效益。本专利技术专利技术人发现，在以初代罗汉果悬浮细胞体系培养成熟罗汉果悬浮细胞过程中，在初期培养基中保持钾离子含量不变，通过控制培养基中钾钠比，能不同程度地提高罗汉果悬浮细胞的生物量，同时加快罗汉果悬浮细胞中罗汉果甜苷V的合成速率。本专利技术的内容可以通过以下技术方案来实现：1.一种通过盐胁迫促进罗汉果悬浮细胞生长及提升甜苷V含量的方法，在以初代罗汉果悬浮细胞体系培养成熟罗汉果悬浮细胞过程中控制体系中钾离子浓度为100～2000mg/kg，钾钠离子浓度比为5～20:1。优选的，所述钾离子浓度为1400mg/kg。优选的，所述钾钠离子浓度比为15:1。优选的，第0～8天开始控制所述钾钠离子浓度比。优选的，第1天开始控制所述钾钠离子浓度比。优选的，使用硫酸钠控制所述钾钠离子浓度比。优选的，培养第15～25天收获所述罗汉果悬浮细胞。优选的，培养第21天收获所述罗汉果悬浮细胞。2.一种通过盐胁迫促进罗汉果悬浮细胞生长及提升甜苷V含量的方法，所述初代罗汉果悬浮细胞体系通过以下步骤获得：步骤一：取罗汉果的种胚，在含有蔗糖25～35g/L、6-苄氨基腺嘌呤0.05～0.15mg/L、萘乙酸2～6mg/L、肌醇50～150mg/L、琼脂4～6g/L、pH范围为5.9～6.0的B5固体培养基上继代培养，选取连续继代3～5次的胚性愈伤组织；步骤二：将步骤一得到的胚性愈伤组织以接种量25～75g/L转接到含有蔗糖20～40g/L、6-苄氨基腺嘌呤0.05～0.15mg/L、萘乙酸3～5mg/L、肌醇50～150mg/L、pH范围为5.9～6.0的B5液体培养基中，并在转速为80～150r/min，培养温度为24～26℃、黑暗的摇床中培养，得初代罗汉果悬浮细胞体系。优选的，所述步骤一继代次数为4次。本专利技术克服了以下难题技术：保持培养基中钾离子含量不变，添加不同含量的硫酸钠来控制培养基中钾钠比，添加后单位时间内罗汉果悬浮细胞干重有所增加，比生长速率有所提高，而且罗汉果甜苷V的合成量有所增加，合成速率也有所提高。与现有技术比较，本专利技术具有以下优点：1.本专利技术以罗汉果种胚为培养原料，分化传代能力更强更稳定，有利于培养得到生长力旺盛、状态稳定均有的罗汉果愈伤组织。2.采用本专利技术方法培养得到的罗汉果细胞培养体系，罗汉果悬浮细胞生物量明显提高，且罗汉果甜苷V产量也明显提高。3.采用本专利技术方法培养得到的罗汉果细胞悬浮体系，细胞比生长速率高，培养周期时间短，降低了操作维护的难度，能更好地满足市场化生产需求。4.本专利技术方法以人工方式调节罗汉果悬浮细胞生物量和罗汉果甜苷V的生产过程，有利于产品的质量控制管理。附图说明：图1罗汉果悬浮细胞生长曲线图2不同处理条件对罗汉果悬浮细胞干重、比生长速率的影响图3罗汉果悬浮细胞培养过程中有机酸的变化图4MVA途径和MEP途径具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用于限制本专利技术的范围。实施例1步骤一：取罗汉果的成熟种胚，在含有蔗糖25g/L、6-苄氨基腺嘌呤0.05mg/L、萘乙酸2mg/L、肌醇50mg/L、琼脂4g/L、pH为5.9的B5固体培养基上继代培养，选取连续继代3次且生长旺盛、质地疏松、状态稳定均一的新鲜胚性愈伤组织；步骤二：将步骤一得到的新鲜胚性愈伤组织以接种量25g/L转接到含有蔗糖20g/L、6-苄氨基腺嘌呤0.05mg/L、萘乙酸3mg/L、肌醇50mg/L、pH为5.9的B5液体培养基中，并在转速为80r/min，培养温度为24℃、黑暗的摇床中培养，得初代罗汉果悬浮细胞体系。步骤三：以步骤二所得初代罗汉果悬浮细胞体系培养成熟罗汉果悬浮细胞；原培养基中钾钠比为25:1，控制本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通过盐胁迫促进罗汉果悬浮细胞生长及提升甜苷V含量的方法，其特征在于，在以初代罗汉果悬浮细胞体系培养成熟罗汉果悬浮细胞过程中控制体系中钾离子浓度为100～2000mg/kg，钾钠离子浓度比为5～20:1。

【技术特征摘要】
1.一种通过盐胁迫促进罗汉果悬浮细胞生长及提升甜苷V含量的方法，其特征在于，在以初代罗汉果悬浮细胞体系培养成熟罗汉果悬浮细胞过程中控制体系中钾离子浓度为100～2000mg/kg，钾钠离子浓度比为5～20:1。2.如权利要求1所述的一种通过盐胁迫促进罗汉果悬浮细胞生长及提升甜苷V含量的方法，其特征在于，所述钾离子浓度为1400mg/kg。3.如权利要求1所述的一种通过盐胁迫促进罗汉果悬浮细胞生长及提升甜苷V含量的方法，其特征在于，所述钾钠离子浓度比为15:1。4.如权利要求1所述的一种通过盐胁迫促进罗汉果悬浮细胞生长及提升甜苷V含量的方法，其特征在于，第0～8天开始控制所述钾钠离子浓度比。5.如权利要求1所述的一种通过盐胁迫促进罗汉果悬浮细胞生长及提升甜苷V含量的方法，其特征在于，第1天开始控制所述钾钠离子浓度比。6.如权利要求1所述的一种通过盐胁迫促进罗汉果悬浮细胞生长及提升甜苷V含量的方法，其特征在于，使用硫酸钠控制所述钾钠离子浓度比。7.如权利要求1所述的一种通过盐胁迫促进罗汉果悬浮细胞生长及提升甜苷V含量的方法，其特征在于，培养第15～25天收获所述罗汉果悬浮...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭美锦，宋云飞，陈雨霞，王泽建，李杰，杨文国，庄英萍，储炬，肖慈英，
申请(专利权)人：华东理工大学，桂林莱茵生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31