一种高密度培养原甲藻的方法技术

本发明专利技术公开了一种高密度培养原甲藻的方法，其包括步骤：(a)在无菌操作室，将原甲藻藻种液接种于装有灭菌的f2培养基的10～50L夹套式玻璃反应釜中，f2培养基的盐度为20‑28；(b)转移至常规实验室，通入灭菌的空气，控制光照度为3000‑5000lux，光/暗周期14h/10h，夹套循环水温度控制22‑25℃，培养10～20天；(c)在无菌操作室，从反应釜出料口放出大部分培养好的藻液，添加新鲜灭菌的f2培养基于反应釜中，转移至常规实验室以步骤b相同条件继续下一个培养周期。本发明专利技术的整个培养过程操作简便，培养体积小而细胞密度极高，能更高效获得其总提取物；且对比大体积玻璃瓶或玻璃缸培养，不需要一直在无菌、恒温的培养室内培养，能耗低。

A method for high density culture of prospella

The present invention discloses a method for high density culture of prospar, which includes steps: (a) in a sterile operating room, the original methylene algae seed liquid is inoculated in a 10 ~ 50L jacket type glass reactor with a sterilized F2 medium, the salinity of the F2 medium is 28; (b) is transferred to the regular laboratory, through the sterilized air to control light The degree is 3000 5000lux, the light / dark cycle 14h/10h, the clamp loop water temperature control 22, 25 degrees, 10~20 days; (c) in the aseptic operating room, the most of the cultured algae liquid is released from the outlet of the reactor, and the fresh sterilized F2 culture is based on the reaction kettle and is transferred to the conventional laboratory for the same condition to continue the next condition in the same condition. Culture cycle. The whole culture process of the invention is simple in operation, small in volume and high in cell density, and can obtain its total extract more efficiently; and compared with large volume glass bottle or glass cylinder, it does not need to be cultivated in the aseptic and constant temperature culture room, and the energy consumption is low.

【技术实现步骤摘要】
一种高密度培养原甲藻的方法
本专利技术属海洋微型单细胞藻类的培养领域，特别是涉及一种高密度培养原甲藻的方法。
技术介绍
海洋生物因富含结构新颖、生物活性显著的次生代谢产物而成为当今最具开发潜力的新药来源，除了海绵、珊瑚、海鞘等海洋无脊椎动物以及放线菌、真菌等海洋微生物之外，海洋微藻资源也是海洋天然药物化学研究的热点对象之一；其代谢产生的聚酮、聚醚、生物碱类成分，因其对哺乳动物的特定毒理表现特征，被划分为神经性贝毒、麻痹性贝毒、腹泻性贝毒、环亚胺毒素等8大类海洋生物毒素，其监测是水产品质量安全核心内容。虽然强烈的毒性限制了海洋生物毒素中大部分化合物在药物开发中的广泛应用，但由于作用靶点特殊、低浓度、高活性等药理特征，经常作为工具药物，并有可能开发成为低剂量(低毒)、高效的特殊用途药物；其中河鲀毒素(tetrodotoxin,TTX)成为毒素开发成新型药物的典型例子。原甲藻(Prorocentrumsp.)属微藻代谢产生的多种骨架类型的聚酮类化合物、生物碱、甾醇等近60余种海洋天然产物，其中OA、DTX-1等34个聚酮类为典型的腹泻性贝毒及其结构类似物，而prorocentrolide、spiro-prorocentrimine等6个生物碱则属于环亚胺类毒素成分，另有新颖的聚酮骨架的大环内酯、链状多烯/多羟基化合物；其中OA、DTX-1等是高选择性的蛋白磷酸酶2A(PP2A)抑制剂。由于在原甲藻或染毒贝类样品中极微量，天然纯化获得的高纯度OA商品价格极高，平均>1000USD/mg，且主要依赖进口，应用于水产品质量安全监测中的腹泻性贝毒标准品。利用产毒的原甲藻ProrocentrummexicanumPM03、ProrocentrumlimaPL11等藻种资源，高密度培养、收集藻细胞，从而实现可持续地产出OA等海洋生物毒素商品，具有较好的市场前景。小体积海洋微藻培养常用光照培养箱静置或通气培养，大容量培养通常在专业的具有无菌、恒温、光照条件的培养室内用玻璃缸、玻璃管道培养。光照培养箱容量小、价格较高，步入式培养室则温控系统能耗高，且要求操作人员无菌防护较为严格。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种可用于规模化培养高密度原甲藻的方法，该方法操作简便，可在减小培养体积的情况下达到收获更多细胞的目标，用常规的20L夹套式玻璃反应釜培养原甲藻PM03、PL11的细胞密度高达2×108cells/L，且对比大体积玻璃瓶或玻璃缸培养，不需要一直在无菌、恒温的培养室内培养，能耗低。过滤培养好的藻液，收集藻细胞-18℃冷冻保藏，可用于提取总毒素等代谢产物，水相通过大孔吸附树脂回收胞外的毒素成分，能更高效获得总提取物。本专利技术的高密度培养原甲藻的方法包括步骤：(a)在无菌操作室，将原甲藻藻种液按照5％-10％的体积比接种于装有灭菌的f2培养基的10～50L夹套式玻璃反应釜中，藻种液浓度为106～108cells/L，f2培养基的盐度为20-28；(b)转移至常规实验室，通入灭菌的空气，控制光照度为3000-5000lux，光/暗周期14h/10h，夹套循环水温度控制22-25℃，培养10～20天至藻液细胞密度达到107～109cells/L；(c)在无菌操作室，从反应釜出料口放出大部分培养好的藻液，留一定比例的体积用于接种，添加新鲜灭菌的f2培养基于反应釜中，转移至常规实验室以步骤b相同条件继续下一个培养周期。本专利技术的一些较佳实施例中，所述原甲藻为PM03或PL11。本专利技术的一些较佳实施例中，步骤a中，夹套式玻璃反应釜容积为20L；步骤b中，灭菌的空气利用充气泵经过0.2μm过滤器和硅胶管通入反应釜中，通气量为2～4L/min，反应釜搅拌转速为60～100rpm/min。优选的，步骤a和c中，接种的体积比为10％。优选的，f2培养基盐度为25。优选的，步骤b中，光照度为3000lux。本专利技术方法用常规的10～50L夹套式玻璃反应釜培养原甲藻藻株PM03、PL11，得到的藻液中，细胞密度高达2×108cells/L。培养体积小而细胞密度极高，能更高效获得其总提取物；且对比大体积玻璃瓶或玻璃缸培养，不需要一直在无菌、恒温的培养室内培养，能耗低。本专利技术的目的还在于提供一种提取所述的藻液中代谢物的方法，其包括步骤：过滤培养好的藻液，收集藻细胞提取总毒素等代谢产物，水相通过大孔吸附树脂回收胞外的毒素成分等代谢产物。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供了新的原甲藻的高密度培养方法，整个培养过程操作简便，用常规的10～50L夹套式玻璃反应釜培养原甲藻藻株PM03、PL11的细胞密度高达2×108cells/L数量级，培养体积小而细胞密度极高，能更高效获得其总提取物；且对比大体积玻璃瓶或玻璃缸培养，不需要一直在无菌、恒温的培养室内培养，能耗低，便于可持续利用原甲藻藻株资源制备海洋生物毒素等代谢产物。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实验中也利用其它常见的培养基包括改变氮/磷比例的f2培养基，改变培养温度等条件，做过类似培养过程，在此不一一列举，仅叙述最简洁有效的培养过程。实施例所用原料：原甲藻藻株ProrocentrummexicanumPM03、ProrocentrumlimaPL11，2014年从台湾大学周宏农教授团队获得，光照培养箱活体传代保种至今。藻株分离培养可参考文献Lu,C.K.；Chou,H.N.；Lee,C.K.；Lee,T.H.Prorocentin,anewpolyketidefromthemarinedinoflagellateProrocentrumlima.Org.Lett.,2005,7(18),3893-6；Lu,C.-K.；Lee,G.-H.；Huang,R.；Chou,H.-N.Spiroprorocentrimine,anovelmacrocycliclactonefromabenthicProrocentrumsp.ofTaiwan.TetrahedronLett.,2001,42,1713-6。f2培养基根据标准方法配制。实施例1在无菌操作室，将盐度为28的19.0L灭菌的f2培养基用灭菌的硅胶管吸入20L夹套式玻璃反应釜中，按照5％的体积比接种浓度为5.0×106cells/L原甲藻PM03，即添加1.0L藻种液。反应釜转移至常规实验室，利用充气泵接灭菌的0.2μm过滤器和硅胶管通气3L/min，反应釜转速80rpm/min，光照5000lux，光/暗周期14h/10h，夹套循环水温度控制22-25℃，培养15天。然后在无菌操作室，从反应釜出料口放出大部分培养好的藻液，留一定比例的体积用于下一个培养周期接种。利用Sedgewick-Rafter板在显微镜下细胞计数得本次培养好的藻液细胞密度为8.97×107cells/L。实施例2延续实施例1，在无菌操作室，在20L夹套式玻璃反应釜中保留细胞密度为8.97×107cells/L的原甲藻PM03藻种液1.5L，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高密度培养原甲藻的方法，其特征在于，包括步骤：(a)在无菌操作室，将原甲藻藻种液按照5％‑10％的体积比接种于装有灭菌的f2培养基的10～50L夹套式玻璃反应釜中，藻种液浓度为106～108cells/L，f2培养基的盐度为20‑28；(b)转移至常规实验室，通入灭菌的空气，控制光照度为3000‑5000lux，光/暗周期14h/10h，夹套循环水温度控制22‑25℃，培养10～20天至藻液细胞密度达到107～109cells/L；(c)在无菌操作室，从反应釜出料口放出大部分培养好的藻液，留一定比例的体积用于接种，添加新鲜灭菌的f2培养基于反应釜中，转移至常规实验室以步骤b相同条件继续下一个培养周期。

【技术特征摘要】
1.一种高密度培养原甲藻的方法，其特征在于，包括步骤：(a)在无菌操作室，将原甲藻藻种液按照5％-10％的体积比接种于装有灭菌的f2培养基的10～50L夹套式玻璃反应釜中，藻种液浓度为106～108cells/L，f2培养基的盐度为20-28；(b)转移至常规实验室，通入灭菌的空气，控制光照度为3000-5000lux，光/暗周期14h/10h，夹套循环水温度控制22-25℃，培养10～20天至藻液细胞密度达到107～109cells/L；(c)在无菌操作室，从反应釜出料口放出大部分培养好的藻液，留一定比例的体积用于接种，添加新鲜灭菌的f2培养基于反应釜中，转移至常规实验室以步骤b相同条件继续下一个培养周期。2.如权利要求1所述的高密度培养原甲藻的方法，其特征在于，所述原甲藻为PM03或PL11。3.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：樊成奇，田晓清，乔玉宝，唐莹莹，陆亚男，马丽艳，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院东海水产研究所，
类型：发明
国别省市：上海,31