一种催化活性得到提高的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种催化活性得到提高的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶的突变体及其应用，具体地，本发明专利技术提供了一种突变的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶，所述突变的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶在包括选自下组的至少3个位点发生突变：在野生型的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶的对应于SEQ ID NO.:1的第73位天冬氨酸(D)、第111位酪氨酸(Y)、第188位天冬酰胺(N)、第250位甘氨酸(G)。本发明专利技术的突变的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶具有非常高的催化活性，此外，本发明专利技术的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶还具有很高的催化效率(高达29.6％)。

A mutant of D- alketide -3- episomerase with improved catalytic activity and its application

The present invention provides a mutant of D alalone 3 differential isomerase with improved catalytic activity and its application, specifically, the invention provides a mutant D aloketone saccharide differential isomerase, and the mutation of D aloketone saccharide 3 differential isomerase at at least 3 loci including the next group. Mutagenesis: in the wild type of D, aralone 3 differential isomerase is corresponding to SEQ ID NO.: seventy-third - bit aspartic acid (D), 111st - bit tyrosine (Y), 188th - bit asparagine (N), and 250th - bit glycine (G). The mutation of the present invention has very high catalytic activity for D alalone 3 differential isomerase, in addition, the invention has high catalytic efficiency (up to 29.6%) of the D alalone isomerase.

【技术实现步骤摘要】
一种催化活性得到提高的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体及其应用
本专利技术涉及生物
，具体地，涉及一种催化活性得到提高的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体及其应用。
技术介绍
D-阿洛酮糖是近年发现的一种具有特殊保健功能的新型功能性稀少糖，它的甜度相当于果糖的70％，能量只有蔗糖的0.3％，具有低能量、改善肠道菌群、降低血糖、抗龋齿、预防肥胖等生理功能。2011年FDA认可D-阿洛酮糖可以作为食品添加剂使用。自此D-阿洛酮糖得到了迅速发展。自然界中，D-阿洛酮糖的含量极少，且极难获得。生物法制备D-阿洛酮糖是近年来的一个研究热点。D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(D-Psicose-3-Epimerase,简写为DPE)属于差向异构酶类，可以催化多种酮糖C3位的差向异构，是生产D-阿洛酮糖的良好的生物催化剂。由于来源于野生菌株未经改造的DPE酶在催化活性方面较差，工业应用存在一定的局限性，导致酶的使用量偏大，应用成本偏高，限制了D-阿洛酮糖的大规模工业化生产。因此，本领域迫切需要开发一种催化活性显著提高的突变的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种催化活性显著提高的突变的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶。本专利技术第一方面提供了一种突变的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶，所述突变的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶在包括选自下组的至少3个位点发生突变：在野生型的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的对应于SEQIDNO.:1的第73位天冬氨酸(D)、第111位酪氨酸(Y)、第188位天冬酰胺(N)、第250位甘氨酸(G)。在另一优选例中，所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶来自于类芽孢杆菌(Paenibacillussenegalensis)。在另一优选例中，所述第73位天冬氨酸(D)突变为谷氨酸(E)；和/或第111位酪氨酸(Y)突变为苯丙氨酸(F)；和/或第188位天冬酰胺(N)突变为苏氨酸(T)；和/或第250位甘氨酸(G)发生突变半胱氨酸(C)。在另一优选例中，所述突变的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的氨基酸序列如SEQIDNO.:2、4、6、8所示。在另一优选例中，所述突变的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶具有选自下组的一个或多个特征：(a)催化效率≥25％，较佳地，26-40％，更佳地，27-30％；(b)所述突变的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的催化活性为同等条件下的野生型D-阿洛酮糖-3-差向异构酶催化活性的3-15倍，较佳地，4-13倍，更佳地，5－10倍；(c)所述突变的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的单位酶活≥400，较佳地，为420-900，更佳地，450-800。在另一优选例中，所述的突变的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶除73、111、188、250位氨基酸外，其余氨基酸与SEQIDNO.:1所示的序列相同或基本相同。在另一优选例中，所述的基本相同是至多有50个(较佳地为1-20个，更佳地为1-10个)氨基酸不相同，其中，所述的不相同包括氨基酸的取代、缺失或添加，且所述的突变蛋白仍具有催化合成阿洛酮糖的活性。在另一优选例中，与SEQIDNO.:1所示序列的同源性至少为80％，较佳地至少为85％-90％，更佳地至少为95％，最佳地至少为98％。在另一优选例中，所述突变的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶为SEQIDNO.:1所示的野生型的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶经突变形成的。本专利技术第二方面提高了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸选自下组：(a)编码如SEQIDNO.:2、4、6、8所示多肽的多核苷酸；(b)序列如SEQIDNO.:3、5、7、9所示的多核苷酸；(c)核苷酸序列与SEQIDNO.:3、5、7、9所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)，且编码SEQIDNO.:1或2、4、6、8所示多肽的多核苷酸；(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。在另一优选例中，所述的多核苷酸在突变的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的ORF的侧翼还额外含有选自下组的辅助元件：信号肽、分泌肽、标签序列(如6His)、或其组合。在另一优选例中，所述的多核苷酸选自下组：DNA序列、RNA序列、或其组合。本专利技术第三方面提供了一种载体，所述载体含有本专利技术第二方面所述的多核苷酸。在另一优选例中，所述载体选自下组：pET、pCW、pUC、pPIC9k、pMA5、或其组合。本专利技术第四方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本专利技术第三方面所述的载体或在基因组中整合有本专利技术第二方面所述的多核苷酸。在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：原核细胞、真核细胞、或其组合。在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、链霉菌、或其组合。在另一优选例中，所述原核细胞包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、和/或谷氨酸棒杆菌，优选大肠杆菌。在另一优选例中，所述真核细胞包括毕赤酵母、黑曲霉、和/或链霉菌，优选毕赤酵母。本专利技术第五方面提供了一种产生本专利技术第一方面所述突变的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的方法，包括步骤：在适合表达的条件下，培养本专利技术第四方面所述的宿主细胞，从而表达出所述突变的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶；和分离所述突变的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶。本专利技术第六方面提供了一种酶制剂，所述酶制剂包含本专利技术第一方面所述的突变的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶。在另一优选例中，所述酶制剂还包括选自下组的一种或多种组分：氯化钴(较佳地，六水合氯化钴)、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、或其组合。在另一优选例中，所述的酶制剂包括注射剂、和/或冻干制剂。本专利技术第七方面提供了一种制备阿洛酮糖的方法，包括步骤：(i)将本专利技术第一方面所述的突变的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶与反应底物接触，进行催化反应，从而获得所述阿洛酮糖；和(ii)任选地，分离并纯化所述阿洛酮糖。在另一优选例中，所述阿洛酮糖为D-阿洛酮糖。在另一优选例中，在步骤(i)中，所述反应底物包括果糖。在另一优选例中，在步骤(i)中，所述反应底物选自下组：结晶果糖、果糖溶液、高果糖浆、或其组合。在另一优选例中，在步骤(i)中，所述催化反应的时间为0.1-10h，较佳地，0.4-8h，更佳地，0.6-5h。在另一优选例中，在步骤(i)中，所述催化反应的温度为20-80℃，较佳地，30-75℃，更佳地，40-70℃。本专利技术第八方面提供了一种本专利技术第一方面所述的突变的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶或本专利技术第四方面所述的宿主细胞的用途，用于产生阿洛酮糖。在另一优选例中，所述阿洛酮糖为D-阿洛酮糖。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1显示D-果糖标准品在HPLC上的保留时间。图2显示D-阿洛酮糖在HPLC上的保留时间。图3显示野生型DPE和突变体酶的单位酶活比较。图4显示野生型DPE酶反应1h的样品HPLC图。图5显示D73E/Y111F/N188T突变体酶反应1h的样品HPLC图。具体实施方式本专利技术人通过广泛而深入的研究，意外地获得一种来源于类芽孢杆菌(Paenibacillussenegalensis)突变的D-阿洛酮糖-3-差本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种突变的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶，其特征在于，所述突变的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶在包括选自下组的至少3个位点发生突变：在野生型的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶的对应于SEQ ID NO.:1的第73位天冬氨酸(D)、第111位酪氨酸(Y)、第188位天冬酰胺(N)、第250位甘氨酸(G)。

【技术特征摘要】
1.一种突变的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶，其特征在于，所述突变的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶在包括选自下组的至少3个位点发生突变：在野生型的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的对应于SEQIDNO.:1的第73位天冬氨酸(D)、第111位酪氨酸(Y)、第188位天冬酰胺(N)、第250位甘氨酸(G)。2.如权利要求1所述的突变的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶，其特征在于，所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶来自于类芽孢杆菌(Paenibacillussenegalensis)。3.如权利要求1所述的突变的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶，其特征在于，所述第73位天冬氨酸(D)突变为谷氨酸(E)；和/或第111位酪氨酸(Y)突变为苯丙氨酸(F)；和/或第188位天冬酰胺(N)突变为苏氨酸(T)；和/或第250位甘氨酸(G)发生突变半胱氨酸(C)。4.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸选自下组：(a)编码如SEQIDNO.:2、4、6、8所示多肽的多核苷酸；(b)序列如SEQIDNO.:3、5、7、9所示的多核苷酸；(c)核苷酸序列与SEQIDNO.:3、5、7、9所示序列的...

【专利技术属性】
技术研发人员：余允东，祝俊，
申请(专利权)人：上海立足生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31