重组酵母及其应用制造技术

本发明专利技术涉及重组酵母及其应用。具体而言，本发明专利技术提供一种重组酵母，其表达来自埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii，最近重命名为埃默森罗萨氏菌(Rasamsonia emersonii))的α‑淀粉酶(SEQ ID NO:1)和葡糖淀粉酶(SEQ ID NO:2)。还公开了所述重组酵母在从淀粉或糖生产醇(特别是生物燃料)的方法中的应用。

Recombinant yeast and its application

The present invention relates to recombinant yeast and its application. In particular, the present invention provides a recombinant yeast that is expressed from the Emerson emersonii (Talaromyces emersonii, the SEQ ID NO:1) and the glucoamylase (SEQ ID NO:2), which are recently renamed Rasamsonia emersonii). The application of recombinant yeast in the production of alcohol (especially biofuels) from starch or sugar is also disclosed.

【技术实现步骤摘要】
重组酵母及其应用
本专利技术涉及用于将可溶性生淀粉转化成如乙醇等醇的重组酵母，特别是用作生物燃料的醇。
技术介绍
经济有效、可再生和可持续的能源是全球关注的问题，其增加了对替代燃料来源的研究力度。富含淀粉的生物质与甘蔗共同代表着生产生物乙醇的主要底物(Bai等，2008)。它由植物作为能量储存库生产，由α-1,4连接的葡萄糖单元和α-1,6分支点组成。直链淀粉和支链淀粉聚合物密集堆积在淀粉颗粒中，形成具有分子间键和分子内键的半结晶结构。淀粉的完全水解需要α淀粉酶和葡糖淀粉酶的组合。淀粉颗粒不溶于冷水，通常耐酶水解(Uthumporn等，2010)。将淀粉转化为乙醇的常规方法需要热密集液化步骤以使淀粉和热稳定的α-淀粉酶糊化，接着用葡糖淀粉酶进行糖化。初始工艺所需的高温通常占乙醇生产所需总能量的约30％至40％(Szymanowska-等，2012)。其替代方法是在低于淀粉开始糊化的温度(对于玉米为65℃)的冷水解法(Robertson等，2006)。该过程的优点包括能源需求减少和干酒糟谷物及可溶物(DDGS)的营养含量更高(Nkomba等，2016)。DDGS在生物乙醇生产过程中大量生产，是家畜饲料的有价值成分(Brehmer等，2008)。联合生物处理(CBP)将酶的生产、水解和发酵组合成在低温下生产生物乙醇的一步法。该技术代表了从木质纤维素和淀粉原料经济地生产生物燃料的有希望的替代方法。CBP可以简化操作过程(例如控制步骤和反应容器的数量)，从而降低维护和生产成本。CBP系统使用能够在低温下产生淀粉水解所需酶的单一生物体，即冷水解，并将所得糖转化为乙醇。冷过程需要能够在发酵条件下有效消化生淀粉的淀粉酶。迄今为止报道了几种生淀粉水解淀粉酶(Mamo和Gessesse，1999；Robertson等，2006；Celińska等，2015)。这些淀粉酶与常规淀粉酶在其与淀粉颗粒的微晶结构的亲和力和相互作用方面不同。淀粉结合结构域(SBD)是这些酶的关键特征，并使其能够有效地结合到生淀粉颗粒的表面。SalehiJouzani和Taherzadeh(2015年)对联合生物处理系统的全面综述强调了不同的CBP策略、底物类型的多样性以及参与将糖类发酵的生物体。主要挑战之一仍然是同时生产具有高底物亲和力和比活性的淀粉酶(denHaan等，2013)。此外，发酵要求在48～72小时内乙醇浓度超过10％～12％(w.v-1)(Bothast和Schlicher，2005)。例如，来自橘林油脂酵母(Lipomyceskononenkoae)和扣囊复膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)(Eksteen等，2003；Knox等，2004)、少根根霉(Rhizopusarrhizus)(Yang等，2011)、塔宾曲霉(Aspergillustubingensis)(Viktor等，2013)和疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginoses)和扣囊复膜酵母(S.fibuligera)或橘林油脂酵母(L.kononenenae)(LKA1)蛋白(US9,243,256)的生淀粉淀粉酶编码基因，已经在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中表达，酿酒酵母是有效的乙醇生产者，但其自身缺乏降解淀粉的能力。然而，这些经转化的酵母中都没有产生足够量的淀粉酶来支持在工业规模的单一步骤中将生淀粉有效地转化成乙醇。尽管分泌葡糖淀粉酶的生物工程化酿酒酵母菌株可商购(来自Lallemand(www.ethanoltech.com/transferm)的)，但其缺乏淀粉液化所需的α淀粉酶(denHaan等，2015)，因此只是半CBP酵母。所以，酵母菌株仅适用于常规(热)过程，因为它仅在淀粉液化后联合糖化和发酵过程。因此，CBP尚未在商业水平上实施，其主要挑战在于获得可表达合适的酶并具有高发酵能力的微生物。已经开发了其它冷同步糖化和发酵(SSF)方法，用于从淀粉底物生产乙醇(Balcerek和Pielech-Przybylska，2013；Szymanowska-等，2014；Nkomba等，2016)。在这些方法中，除了酵母之外，将颗粒淀粉水解酶(GSHE)混合物加入到原料中。Genencor的STARGEN001TM和STARGEN002TM混合物(Dupont-Danisco，Itasca，Itasca)在低温(对于SSF推荐48℃)水解生淀粉，而POET(SiouxFalls,SouthDekota,美国)在SSF方法中使用Novozymes酶的专利混合物(POETBPX技术)(等，2015)。然而，这些冷淀粉水解方法需要高的酶加载量，并且例如STARGENTM(GenencorInternational,California,美国)等商业酶的成本高。因此，仍然需要一种酵母，其可用于从生淀粉生产乙醇的CBP方法中，而无需从除酵母以外的来源添加淀粉酶。
技术实现思路
根据本专利技术的第一方面，提供一种重组酵母，其已经转化有下述基因：a)第一异源基因，其编码包含与SEQIDNO:1具有至少70％同一性的氨基酸序列的α-淀粉酶，其中第一基因的核酸序列是未经密码子优化的；和b)第二异源基因，其编码包含与SEQIDNO:2具有至少70％同一性的氨基酸序列的葡糖淀粉酶，其中第二基因的核酸序列是可选地经密码子优化的。α-淀粉酶的氨基酸序列可以与SEQIDNO:1具有至少80％同一性；α-淀粉酶的氨基酸序列可以与SEQIDNO:1具有至少90％同一性；或者α-淀粉酶的氨基酸序列可以与SEQIDNO:1相同。葡糖淀粉酶的氨基酸序列可以与SEQIDNO:2具有至少80％同一性；葡糖淀粉酶的氨基酸序列可以与SEQIDNO:2具有至少90％同一性；或者葡糖淀粉酶的氨基酸序列可以与SEQIDNO:2相同。第一异源基因的核酸序列可以与SEQIDNO:3具有至少70％同一性，与SEQIDNO:3具有至少80％同一性，与SEQIDNO:3具有至少90％同一性，或可以与SEQIDNO:3相同。第二异源基因的核酸序列可以与SEQIDNO:4和5中任一个具有至少70％同一性，这取决于所述序列是否已经进行了密码子优化；以及可以与SEQIDNO:4和5中任一个具有至少80％同一性，与SEQIDNO:4和5中任一个具有至少90％同一性，或者可以与SEQIDNO:4和5中任一个相同。酵母可以是酵母菌属(Saccharomyces)物种，例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。酵母可以是能够将诸如葡萄糖等糖转化成醇的酵母。醇可以是丁醇或乙醇，特别是乙醇。重组酵母能够在不存在来自除重组酵母之外的来源的酶时水解生淀粉。生淀粉可以在约40℃以下进行水解。根据本专利技术的第二实施方式，提供一种用于从糖生产醇的方法，所述方法包括使用上述重组酵母将糖转化成醇的步骤。所述糖可以包含葡萄糖。醇可以是乙醇或丁醇，通常是乙醇。根据本专利技术的第三实施方式，提供了一种用于从淀粉生产醇的方法，所述方法包括使用上述重组酵母将淀粉转化成醇的步骤。重组酵母可以添加至包含淀粉或糖的组合物，并且可以使其表达和分泌：(i)包含与SEQIDNO本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组酵母，其已经转化有下述基因：a)第一异源基因，其编码包含与SEQ ID NO:1具有至少70％同一性的氨基酸序列的α‑淀粉酶，其中该第一基因的核酸序列是未经密码子优化的；和b)第二异源基因，其编码包含与SEQ ID NO:2具有至少70％同一性的氨基酸序列的葡糖淀粉酶，其中该第二基因的核酸序列是可选地经密码子优化的。

【技术特征摘要】
2016.12.05 GB 1620658.31.一种重组酵母，其已经转化有下述基因：a)第一异源基因，其编码包含与SEQIDNO:1具有至少70％同一性的氨基酸序列的α-淀粉酶，其中该第一基因的核酸序列是未经密码子优化的；和b)第二异源基因，其编码包含与SEQIDNO:2具有至少70％同一性的氨基酸序列的葡糖淀粉酶，其中该第二基因的核酸序列是可选地经密码子优化的。2.如权利要求1所述的重组酵母，其中：所述α-淀粉酶的氨基酸序列与SEQIDNO:1具有至少80％或至少90％同一性；和/或所述葡糖淀粉酶的氨基酸序列与SEQIDNO:2具有至少80％或至少90％同一性。3.如权利要求1所述的重组酵母，其中：所述第一基因的核酸序列与SEQIDNO:3具有至少70％同一性；所述第二基因的核酸序列是经密码子优化的，并且与SEQIDNO:4具有至少70％同一性；和/或所述第二基因的核酸序列是未经密码子优化的，并且与SEQIDNO:5具有至少70％同一性。4.如权利要求1所述的重组酵母，其中，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·A·克里普沃尔，W·H·范兹尔，S·H·罗斯，
申请(专利权)人：斯坦陵布什大学，
类型：发明
国别省市：南非,ZA