一种固液双相酶解与超滤联用制备超低分子量透明质酸寡糖及其盐的方法技术

本发明专利技术公开了一种固液双相酶解与超滤联用制备超低分子量透明质酸寡糖及其盐的方法，该方法利用芽孢杆菌产生的透明质酸酶降解透明质酸及其盐，采用固液双相酶解与超滤系统联用的方法制得高浓度透明质酸酶解液，进而通过灭活、活性炭吸附除杂、过滤、喷雾干燥得到分子量≤3kDa的超低分子量透明质酸寡糖及其盐。本发明专利技术所得产品稳定性好、分子量超低，抗炎、透皮吸收性好、纯度高、无细胞毒性、抗氧化能力强，具有皮肤细胞损伤修复等优点，可广泛应用在化妆品、食品及医药领域。该方法工艺流程操作简单，条件温和，不使用各种醇，能耗相对较低，对产品结构无破坏，无环境污染，适合大规模工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种固液双相酶解与超滤联用制备超低分子量透明质酸寡糖及其盐的方法
本专利技术涉及一种酶切法制备透明质酸寡糖及其盐的工艺，特别是涉及一种固液双相酶解与超滤联用制备具有超低分子量的透明质酸寡糖及其盐的方法，属于透明质酸

技术介绍
透明质酸(hyaluronicacid，HA)是一种酸性黏多糖，是由N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖重复单位通过β-(1→4)糖苷键和β-(1→3)糖苷键构成的无分支高分子糖胺聚糖，存在于动物组织细胞间质和某些细菌的荚膜中。透明质酸广泛用于医药、化妆品、食品等领域，分子量一般为105~107Da（道尔顿）。寡聚透明质酸是指分子量小于10kDa的透明质酸，而超低分子量透明质酸寡糖主要是指分子量≤3kDa的透明质酸盐。不同分子量的透明质酸表现出不同的生物活性，低分子量透明质酸甚至表现出与高分子量透明质酸完全相反的活性。很多文献都对透明质酸在创伤修复中发挥的作用进行了报道，尤其是低分子量及透明质酸寡糖作为活性物质受到更多关注。有研究认为，当透明质酸的分子量降低至寡糖的水平时（10kDa以下），透明质酸寡糖能够抑制细胞炎性因子的产生，防止创伤愈合过程中产生过度的炎症反应（KimMY,MutoJ,GalloRL.HyaluronicAcidOligosaccharidesSuppressTLR3-DependentCytokineExpressioninaTLR4-DependentManner[J].PlosOne,2013,8(8):65-65）。也有文献报道，对于由人体皮肤对正常的外部环境刺激产生过度的炎症反应引起的红斑痤疮，透明质酸寡糖能够抑制皮肤产生抗菌肽，减轻炎症反应（LeeH,LeeS.263Hyaluronicacidoligosaccharidessuppresscytokineexpressioninducedbycathelicidinepeptides[J].JournalofInvestigativeDermatology,2016,136(9):S206-S206）。目前，分子量≤3kDa的超低分子量透明质酸寡糖通常采用生物酶解法进行降解得到，而物理法或化学法降解无法获得超低分子量透明质酸寡糖。酶解法降解透明质酸具有只断裂单糖分子间的糖苷键、不会对结构造成破坏、反应条件温和、制备的透明质酸寡糖不会发生褐变、不会造成环境污染的优点。但是，随着降解所得的透明质酸的分子量的降低，降解过程所需的酶量会越来越多，酶解法制备透明质酸寡糖需要的酶量远远大于制备低分子量透明质酸所需要的酶量，而商品化的透明质酸酶价格高昂，因此一直无法进行大规模工业化生产制备透明质酸寡糖。此外，透明质酸作为高分子多糖，其溶液黏度随着分子量、浓度的升高而升高，在酶解过程中，透明质酸加入酶解液中容易形成外部液体内部固体的包块，透明质酸分散过程耗时耗力。同时，高浓度透明质酸溶液会形成一种致密的弹性体，阻碍透明质酸酶与透明质酸的构象转变，影响底物透明质酸与透明质酸酶活性中心的结合，降低酶解速率，需要加入更多的透明质酸酶才能将高分子透明质酸降解至目标分子量。
技术实现思路
针对超低分子量透明质酸寡糖制备存在的不足，本专利技术提供了一种固液双相酶解与超滤联用制备超低分子量透明质酸寡糖（≤3kDa）及其盐的方法，该方法采用固液双相酶解，透明质酸不会形成包块和致密弹性体，提高了酶解速率，同时酶解后期与超滤联用，将部分超低分子量透明质酸寡糖持续分离出来，降低了酶的用量，大大降低了生产成本。本专利技术采用申请人自行筛选的芽孢杆菌（Bacillussp.）A50（保藏号CGMCCNO.5744）发酵纯化得到的透明质酸酶为生物酶对高分子量透明质酸或其盐进行降解，该酶酶活高，热稳定性和pH稳定性高，可以采用工业化生产的方法获得，用其制备超低分子量透明质酸寡糖及其盐可以使生产成本得到有效的降低。酶解过程是：前期先采用固液双相酶解得到高浓度透明质酸及其盐的酶解液，酶解后期将酶解与超滤联用，边酶解边通过超滤将产生的超低分子量的透明质酸寡糖及其盐从体系中分离出来，最后经灭活、过滤、喷雾干燥得到超低分子量透明质酸寡糖及其盐。该方法大幅度提高了酶解效率，降低了透明质酸酶的用量，生产成本低，为酶解法制备超低分子量透明质酸寡糖及其盐的工业化大规模生产提供了有效的技术支持。本专利技术具体技术方案如下：一种固液双相酶解与超滤联用制备超低分子量透明质酸寡糖及其盐的方法，该方法包括以下步骤：（1）酶解缓冲液准备：调节纯化水pH为4~9、温度为20~48℃，然后加入芽孢杆菌透明质酸酶，配成酶解缓冲液；（2）固液双相酶解：在搅拌下向酶解缓冲液中加入氧化锆分散珠，再快速加入高分子量的透明质酸或其盐固体至其质量体积浓度为5~25%，搅拌混匀，得到透明质酸-酶解液固液双相酶解体系；在搅拌下酶解至固液双相酶解体系转变为液液单相酶解体系后，再次快速加入高分子量的透明质酸或其盐固体至其质量体积浓度为5~25%，搅拌混匀形成透明质酸-酶解液固液双相酶解体系，继续搅拌酶解，直至固液双相酶解体系转变为液液单相酶解体系；（3）超滤：酶解体系变为液液单相酶解体系时，将酶解反应液与超滤系统连接，边超滤边酶解，直至酶解反应液中的透明质酸或其盐的分子量≤3kDa，控制超滤条件使酶解结束时超滤滤出的清液为酶解反应液的40-60%；（4）后处理：合并超滤滤出的清液和剩余的酶解反应液，进行灭活、活性炭吸附、过滤处理，过滤所得滤液进行喷雾干燥，得到分子量≤3kDa的超低分子量透明质酸寡糖及其盐（简称透明质酸寡糖及其盐，下同）。本专利技术方法中，所用的芽孢杆菌透明质酸酶为芽孢杆菌（Bacillussp.）A50CGMCCNO.5744纯化得到的透明质酸酶，该酶的制备在专利CN201210317032.5中有详细的记载，该透明质酸酶对透明质酸有很好的降解性，通过控制酶解条件可以得到所需分子量的透明质酸。该透明质酸酶酶活高，纯化得到的芽孢杆菌透明质酸酶的比活为8×106~1.5×107IU/mg。进一步的，步骤（2）中，所述高分子量的透明质酸及其盐固体的分子量大于10kDa，例如10-1000kDa，优选为100kDa~1000kDa或300~1000kDa。所述高分子量的透明质酸的盐为透明质酸的钠盐、钾盐、镁盐、钙盐或锌盐。进一步的，酶解液中芽孢杆菌透明质酸酶的用量与步骤（2）中加入的高分子量的透明质酸或其盐固体的总质量的关系为：每降解1kg分子量大于10kDa的透明质酸或其盐固体需要4×105~1×106IU的芽孢杆菌透明质酸酶。进一步的，本专利技术将高分子量的透明质酸及其盐固体快速加入酶解液中，使透明质酸及其盐在固液双相状态下发生酶解，能更好的与透明质酸酶接触，提高酶解速率。本专利技术在酶解体系中加入氧化锆分散珠，并全程在搅拌下进行，控制搅拌速度结合分散珠的分散作用，透明质酸盐及其盐固体不会在加入过程中产生包块，在后期降解过程中也不会形成致密的弹性体。优选的，步骤（2）中，在30-40rmp的搅拌速度下加入高分子量的透明质酸及其盐固体，加入后再在此速度下搅拌3-5min，然后将搅拌速度调整为15-20rpm并一直保持该搅拌速度进行固液双相酶解。步骤（3）中，当超滤与酶解联用后，将酶解搅拌速度本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种固液双相酶解与超滤联用制备超低分子量透明质酸寡糖及其盐的方法，其特征是包括以下步骤：（1）酶解缓冲液准备：调节纯化水pH为4~9、温度为20~48℃，然后加入芽孢杆菌透明质酸酶，配成酶解缓冲液；（2）固液双相酶解：在搅拌下向酶解缓冲液中加入氧化锆分散珠，再快速加入高分子量的透明质酸或其盐固体至其质量体积浓度为5~25%，搅拌混匀，得到透明质酸‑酶解液固液双相酶解体系；在搅拌下酶解至至固液双相酶解体系转变为液液单相酶解体系后，再次快速加入高分子量的透明质酸或其盐固体至其质量体积浓度为5~25%，搅拌混匀形成透明质酸‑酶解液固液双相酶解体系，继续搅拌酶解，直至固液双相酶解体系转变为液液单相酶解体系；（3）超滤：酶解体系变为液液单相酶解体系时，将酶解反应液与超滤系统连接，边超滤边酶解，直至酶解反应液中的透明质酸或其盐的分子量≤3kDa，控制超滤条件使酶解结束时超滤滤出的清液体积为酶解反应液的40‑60%；（4）后处理：合并超滤滤出的清液和剩余的酶解反应液，进行灭活、活性炭吸附、过滤处理，过滤所得滤液进行喷雾干燥，得到分子量≤3kDa的超低分子量透明质酸寡糖及其盐。

【技术特征摘要】
1.一种固液双相酶解与超滤联用制备超低分子量透明质酸寡糖及其盐的方法，其特征是包括以下步骤：（1）酶解缓冲液准备：调节纯化水pH为4~9、温度为20~48℃，然后加入芽孢杆菌透明质酸酶，配成酶解缓冲液；（2）固液双相酶解：在搅拌下向酶解缓冲液中加入氧化锆分散珠，再快速加入高分子量的透明质酸或其盐固体至其质量体积浓度为5~25%，搅拌混匀，得到透明质酸-酶解液固液双相酶解体系；在搅拌下酶解至至固液双相酶解体系转变为液液单相酶解体系后，再次快速加入高分子量的透明质酸或其盐固体至其质量体积浓度为5~25%，搅拌混匀形成透明质酸-酶解液固液双相酶解体系，继续搅拌酶解，直至固液双相酶解体系转变为液液单相酶解体系；（3）超滤：酶解体系变为液液单相酶解体系时，将酶解反应液与超滤系统连接，边超滤边酶解，直至酶解反应液中的透明质酸或其盐的分子量≤3kDa，控制超滤条件使酶解结束时超滤滤出的清液体积为酶解反应液的40-60%；（4）后处理：合并超滤滤出的清液和剩余的酶解反应液，进行灭活、活性炭吸附、过滤处理，过滤所得滤液进行喷雾干燥，得到分子量≤3kDa的超低分子量透明质酸寡糖及其盐。2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述芽孢杆菌透明质酸酶为芽孢杆菌（Bacillussp.）A50CGMCCNO.5744发酵得到；酶解液中芽孢杆菌透明质酸酶的用量与步骤（2）中加入的高分子量的透明质酸或其盐固体的总质量的关系为：每1kg高分子量的透明质酸或其盐固体需要4×105~1×106IU的芽孢杆菌透明质酸酶。3.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述高分子量的透明质酸及其盐固体的分子量大于10kDa，优选为100kDa~1000kDa；所述高分子量的透明质酸盐为透明质酸的钠盐、钾盐、镁盐、钙盐或锌盐...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔莉苹，申凤同，陆震，薛蔚，吕旸，范馨仪，石艳丽，郭学平，
申请(专利权)人：华熙福瑞达生物医药有限公司，山东华熙海御生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37