鞍带石斑鱼抗缪勒氏管激素AMH基因、编码蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种鞍带石斑鱼抗缪勒氏管激素AMH基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。还公开了该基因编码的蛋白，以上述抗缪勒氏管激素AMH基因为目的基因生产抗缪勒氏管激素AMH重组蛋白的制备方法以及由该方法获得的鞍带石斑鱼抗缪勒氏管激素AMH重组蛋白为抗原，免疫动物制备所得的多克隆抗体。本发明专利技术进一步公开了上述鞍带石斑鱼抗缪勒氏管激素AMH重组质粒在制备鞍带石斑鱼性转变过程中的诱导剂中的应用以及该多克隆抗体在制备鞍带石斑鱼不同发育时期检测剂中的应用。

【技术实现步骤摘要】
鞍带石斑鱼抗缪勒氏管激素AMH基因、编码蛋白及其应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及鞍带石斑鱼抗缪勒氏管激素AMH基因、编码蛋白及其应用。
技术介绍
抗缪勒氏管激素(anti-Mullerianhormone,AMH)，也被称为缪勒氏管抑制物(mullerianinhibitingsubstance,MIS)，由于在雄性胚胎发育过程中可以引起缪勒氏管退化、并阻止雌性生殖器官发育而命名。AMH基因最初是从牛中克隆得到。哺乳类中，胚胎期精巢发育是被Y染色体上的SRY基因启动的，在其他转录因子(SF-1,Wt1和GATA-4)的帮助下，刺激雄性睾丸中支持细胞表达AMH从而引起缪勒氏管退化，并使个体向雄性方向发育。AMH同样可以抑制cAMP和FSH，来间接的影响了胚胎精巢去表达Cyp19a1，而Cyp19a1的作用是可以编码P450芳香化酶来催化使雄激素转变为雌激素。与哺乳动物相比，由于鱼类性腺分化的分子遗传调节机制的复杂性及研究起步较晚，所以到目前为止还未研究透彻。因为硬骨鱼类中并未发现缪勒氏管，所以硬骨鱼类中AMH及其受体功能尚未清楚。鞍带石斑鱼因其味道鲜美、营养丰富而广受欢迎，是一种具有很高经济价值的食用鱼类。鞍带石斑鱼是典型的雌雄同体鱼类，生殖过程中要经历雌性过程后，再转变为雄性，生殖周期很长，获得雄性一般都需要6年以上，在进行人工繁殖时，雄性亲鱼非常稀缺。而且由于环境的破坏和过渡捕捞，在自然海域中捕捞到野生雄性亲鱼机会更加渺茫。因此，如何获得功能性的雄性亲鱼成为鞍带石斑鱼人工繁育工作能否顺利进行的关键。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种鞍带石斑鱼抗缪勒氏管激素AMH基因、编码该基因的蛋白以及该抗缪勒氏管激素AMH基因的制备方法。本专利技术所要解决的另一个技术问题在于提供一种以上述抗缪勒氏管激素AMH基因为目的基因生产抗缪勒氏管激素AMH重组蛋白的制备方法、由该方法生产的抗缪勒氏管激素AMH重组蛋白以及多克隆抗体。本专利技术进一步所要解决的技术问题在于提供上述鞍带石斑鱼抗缪勒氏管激素AMH重组质粒在制备鞍带石斑鱼性转变过程中的诱导剂中的应用以及上述多克隆抗体在制备鞍带石斑鱼不同发育时期检测剂中的应用。为解决上述问题，本专利技术提供的鞍带石斑鱼抗缪勒氏管激素AMH基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。该鞍带石斑鱼抗缪勒氏管激素AMH基因，其通过引物扩增基因片段和RACE全长扩增的方法得到鞍带石斑鱼抗缪勒氏管激素AMH基因开放读码框。本专利技术中的鞍带石斑鱼抗缪勒氏管激素AMH蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示，其编码518个氨基酸，分子量为72.5千道尔顿。在该序列的N端含有一段66个氨基酸的信号肽序列，在靠近其氨基酸序列C端存在9个保守的半胱氨酸的生物活性区，这与其它已鉴定的AMH一致。上述鞍带石斑鱼抗缪勒氏管激素AMH基因的制备方法，包括以下步骤：(1)从已有的中国鞍带石斑鱼中提取总RNA；(2)以步骤(1)所提取的总RNA为模板，以RNAOligodT为引物，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示，逆转录合成cDNA；(3)以cDNA为模板，以SEQIDNO：4、SEQIDNO：5所示的序列为上、下游引物，通过PCR扩增，得到鞍带石斑鱼抗缪勒氏管激素AMH基因。本专利技术还提供了一种表达载体，含有上述的抗缪勒氏管激素AMH基因。在上述表达载体中，所述表达载体优选为大肠杆菌表达载体pET32a-AMH。本专利技术还提供了一种重组株，由上述的大肠杆菌表达载体pET32a-AMH转入大肠杆菌Rosetta菌株中所形成的大肠杆菌重组株pET32a-AMH-Rosetta。鞍带石斑鱼抗缪勒氏管激素AMH蛋白是通过重组表达载体pET32a-AMH，在大肠杆菌ROsetta菌株中以胞内包涵体形式表达获得的。进一步的，本专利技术提供的鞍带石斑鱼抗缪勒氏管激素AMH重组蛋白的表达方法，包括以下步骤：(1)重组表达载体pET32a-AMH的构建；(2)重组表达载体pET32a-AMH转化大肠杆菌Rosetta菌株；(3)培养表达工程菌；(4)抗缪勒氏管激素AMH重组质粒包被；(5)抗缪勒氏管激素AMH蛋白的纯化和变复性处理。其中步骤(1)中重组表达载体pET32a-AMH的构建包括以下步骤：(a)合成一对引物，其上游引物如SEQIDNO:6所示，其下游引物如SEQIDNO:7所示，其中上游引物SEQIDNO:6带有EcoRI切割位点，下游引物SEQIDNO:7带有XhoI切割位点，(b)以含鞍带石斑鱼抗缪勒氏管激素AMH编码基因的质粒为模板，以引物SEQIDNO:6和SEQIDNO:7扩增AMH基因表达成熟肽的DNA序列；(c)将PCR扩增产物克隆到原核表达载体pET32a上，得到重组表达载体pET32a-AMH。本专利技术通过设计一对含有EcoRI酶切位点的上游引物SEQIDNO:6和含有XhoI酶切位点的下游引物SEQIDNO:7，将鞍带石斑鱼抗缪勒氏管激素AMH的成熟肽编码序列克隆至原核表达载体pET-32a上，构建重组表达载体pET-32a-AMH，该重组载体含有6×His亲和标签位点，以T7为启动子，获得的目的蛋白C端具有6×His结构，便于利用镍柱亲和层析进行纯化。通过对培养温度和诱导剂量等条件的摸索和优化，重组蛋白AMH的表达量较高，但绝大部分处于包涵体状态。步骤(3)中培养表达工程菌优选包括以下步骤：将单菌落接种至5mL含100mg/L氨苄青霉素抗性的LB培养基，37℃，200rpm振荡过夜培养(约12h)，取过夜培养物以1:100比例接种于含100mg/L氨苄青霉素LB培养基中，37℃，200rpm培养至OD600达到0.6(约3h)，加入终浓度为0.8mmol/L的IPTG，37℃、200rpm诱导培养6小时，可以获得最大重组蛋白表达量，10000rpm离心15min，收集菌体即得。步骤(5)中的抗缪勒氏管激素AMH蛋白的纯化和变复性处理包括以下步骤：(A)将收集的菌体用buffferB洗涤，再用适量buffferB重悬，冰上震荡裂解菌体1h，经高速离心获得裂解上清液；(B)将收集的裂解液经镍柱亲和层析纯化，尿素洗脱液进行洗脱处理，收集蛋白洗脱峰；(C)将收集的蛋白洗脱液预冷后放入处理好的透析袋中，两侧袋口扎紧转移至透析液，4℃透析过夜，每隔8h更换新的透析液，透析结束后将蛋白真空冻干。本专利技术还提供了采用上述表达方法获得的鞍带石斑鱼抗缪勒氏管激素AMH重组蛋白并制备抗体。本专利技术还进一步提供了上述表达方法获得的鞍带石斑鱼抗缪勒氏管激素AMH重组质粒在制备鞍带石斑鱼性转变过程中的诱导剂中的应用。本专利技术对重组表达AMH质粒进行包被后进行投喂实验，发现在投喂数周之后，鞍带石斑鱼卵巢出现退化并朝着精巢方向发展，这为后续鞍带石斑鱼性逆转的人工诱导提供了一种新型的诱导模式，可以增强和加快性逆转的作用时间。因此，本专利技术中以鞍带石斑鱼抗缪勒氏管激素AMH基因及其编码蛋白，构建了AMH蛋白重组表达质粒，可以诱导雌性鞍带石斑鱼性转变为雄性。更进一步的，该鞍带石斑鱼抗缪勒氏管激素AMH重组蛋白制备的特异性抗体还可以作为鞍带石斑鱼雄性的辅助检测剂。一种多克隆抗体，以上述表达方法获得的鞍带石斑鱼抗缪勒氏管激素A本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鞍带石斑鱼抗缪勒氏管激素AMH基因，其特征是：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种鞍带石斑鱼抗缪勒氏管激素AMH基因，其特征是：其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.一种鞍带石斑鱼抗缪勒氏管激素AMH蛋白，其特征是：其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。3.权利要求1所述的鞍带石斑鱼抗缪勒氏管激素AMH基因的制备方法，其特征是包括以下步骤：(1)从已有的中国鞍带石斑鱼中提取总RNA；(2)以步骤(1)所提取的总RNA为模板，以RNAOligodT为引物，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示，逆转录合成cDNA；(3)以cDNA为模板，以SEQIDNO：4、SEQIDNO：5所示的序列为上、下游引物，通过PCR扩增，得到鞍带石斑鱼抗缪勒氏管激素AMH基因。4.一种表达载体，其特征是：含有权利要求1所述的抗缪勒氏管激素AMH基因。5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征是：所述表达载体为大肠杆菌表达载体pET32a-AMH。6.一种重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：张勇，韩玉龙，赵密，彭诚，杨宇晴，李水生，刘云，张海发，林浩然，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44