一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法技术

本发明专利技术公开了一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法，该方法包括抗原致敏及免疫抑制阻断、T细胞亚群分离和刺激增殖、T细胞亚群的再刺激和快速增殖及收获四个步骤。具有利于T细胞特异性活化、可提高T细胞抗肿瘤能力、提升肿瘤特异性T细胞数量、操作简便且易于推广的特点。

【技术实现步骤摘要】
一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法
本专利技术属于医疗卫生
，具体来说涉及一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法。
技术介绍
肿瘤免疫治疗，是应用免疫学原理和方法，提高肿瘤细胞的免疫原性和/或对淋巴细胞杀伤的敏感性，激发和增强机体抗肿瘤免疫应答，并应用免疫细胞和/或效应分子输注宿主体内，协同机体免疫系统杀伤肿瘤、抑制肿瘤生长。在众多肿瘤免疫治疗方案中，“过继性T淋巴细胞输注”是重要的一种，它指将体外激活、扩增的自体或异体抗肿瘤T淋巴细胞输注给患者，杀伤患者体内的肿瘤细胞的过程。在过继性T细胞免疫治疗中，T细胞的来源主要有两个方面，即外周血及肿瘤组织。其中，最容易采集和分离的是外周血T细胞，但这种来源的T细胞由于远离肿瘤区域(这里主要指非血液系统肿瘤)，未受过肿瘤刺激，因此肿瘤特异性T细胞含量较少；同时大部分外周血T细胞属于分化终末期的效应T细胞，寿命较短，扩增效率较差。所以，目前采用较多的是肿瘤浸润T细胞,即从肿瘤组织中分离的T细胞，这部分T细胞与肿瘤近距离接触，有部分识别肿瘤的能力，但含量少、难于分离，且因处于肿瘤微环境中，抗肿瘤能力受到抑制。淋巴结是哺乳动物特有的次级免疫器官，其中含有大量淋巴细胞，是发生免疫识别和免疫效应的场所。淋巴结中的淋巴细胞接受刺激以后，会产生大量的细胞因子、免疫活化蛋白和抗体等，能对病原物或肿瘤细胞产生杀伤作用。因此，理论上，淋巴结应是一道免疫屏障，可阻止肿瘤细胞的迁徙与扩散,且淋巴结中存在肿瘤特异性T细胞。然而，随着肿瘤免疫研究的发展，发现肿瘤微环境(肿瘤细胞与其周围的间质细胞和淋巴细胞等共同组成的局部区域)中的免疫抑制能够阻碍淋巴细胞发挥正常功能。肿瘤转移淋巴结中，肿瘤细胞产生的负向免疫调节能够诱导淋巴细胞向免疫抑制性细胞分化，可以通过分泌免疫检测点蛋白使淋巴细胞失活，甚至逆转淋巴细胞功能向促进肿瘤生长和转移的方向转变。正是因为肿瘤细胞对微环境的这种“驯化”，使得淋巴细胞无法识别肿瘤细胞或者失去本应有的抗肿瘤活性，导致免疫屏障的淋巴结失去屏障功能，甚至变成帮助肿瘤转移的渠道。因此，挑选合适的淋巴结是得到特异性抗肿瘤T细胞的关键。研究表明，扩增大量肿瘤特异性T细胞的数量是取得前述过继性T细胞免疫治疗良好效果的关键，回输T细胞的数量与抗肿瘤效果呈正相关。故，获取高效的T细胞体外扩增方法是本领域呈待解决的技术问题。目前，就已有T细胞的体外扩增方法而言，除T细胞取材、体外激活和扩增过程获得肿瘤特异性T细胞数量不够外，还存在如下3个方面的问题：(1)采用肿瘤匀浆裂解物作为抗原刺激T细胞增殖，因肿瘤匀浆物成分复杂，其中包含大量死细胞释放的因子和免疫抑制因子，这些成分不利于T细胞的特异性活化；(2)在培养过程中会造成诱导性的免疫抑制效应(如程序性死亡受体1的升高等)，降低T细胞的抗肿瘤能力；(3)使用单一细胞因子扩增T细胞，会造成T细胞的亚群极化，使得单一亚群的抗肿瘤功能弱于混合亚群。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服前述困难而提供一种利于T细胞特异性活化、可提高T细胞抗肿瘤能力、提升肿瘤特异性T细胞数量、操作简便且易于推广的非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法。本专利技术的一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法，包括以下步骤：(2)抗原致敏及免疫抑制阻断：a、取体积比为100:2-5的淋巴细胞培养基、胎牛血清混合，得淋巴细胞培养基、胎牛血清混合物；在淋巴细胞培养基、胎牛血清混合物中加入白细胞介素2，调整所述白细胞介素2在淋巴细胞培养基、胎牛血清混合物中的浓度为100-1000单位/毫升，得培养液A，备用；b、取部分培养液A，加入非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞，调整培养液体积，使所述非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞在培养液A中的密度为1*106-2*106个/毫升，培养12-24小时；c、另取部分培养液A，加入抗免疫抑制抗体进行免疫抑制阻断，得培养液B，备用；d、将在培养液A中培养12-24小时后得到的非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞全部吸出，转移至离心管中，离心3-5分钟，离心力为300-350g；离心完成后弃掉上层培养液；e、在离心完成后弃掉上层培养液的非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞中加入培养液B，调整所述非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞在培养液B中的浓度为0.5*106-1*106个/毫升，培养24-48小时后，加入细胞培养用常规人工合成肿瘤多肽，调整所述细胞培养用常规人工合成肿瘤多肽在所加入体系中的浓度为0.5-1微克/毫升，继续培养24-48小时，得非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞培养物；(2)T细胞亚群分离和刺激增殖：采用常规分选方法对非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞培养物进行亚群分选，得到CD4+、CD25-辅助T细胞亚群和CD8+杀伤性T细胞亚群，将两个亚群分别置于X-VIVO培养基中独立培养并加入激活试剂，培养密度为1*105-1*107个/毫升，各组每隔3天进行半量换液，培养9-12天后分别进行细胞计数；其中，CD4+、CD25-辅助T细胞亚群的激活试剂为：CD3/CD28磁珠及白细胞介素7，调整所述CD3/CD28磁珠在所加入体系中为1-5个/细胞、白细胞介素7的浓度为5-20纳克/毫升；CD8+杀伤性T细胞亚群的激活试剂为：anti-CD3、白细胞介素7及白细胞介素21，调整所述anti-CD3在所加入体系中的浓度为5-50纳克/毫升、白细胞介素7的浓度为2-20纳克/毫升、白细胞介素21的浓度为1-5纳克/毫升；(3)T细胞亚群的再刺激和快速增殖：上阶段培养结束后，加入经15-35千戈瑞X射线辐照的外周血单个核细胞，所述外周血单个核细胞与CD4+、CD25-辅助T细胞亚群和CD8+杀伤性T细胞亚群经培养9-12天后所得细胞的数量比例为100-500:1，加入细胞培养用常规人工合成肿瘤多肽，调整所述细胞培养用人工合成肿瘤多肽在所加入体系中的的浓度为0.5-3微克/毫升，继续培养12-15天，培养过程中控制培养密度为1*106-2*106个/毫升；(4)收获：培养结束后，在CD4+、CD25-辅助T细胞亚群和CD8+杀伤性T细胞亚群中分别取样培养细胞，进行微生物、内毒素、流式细胞学和细胞因子分泌分析后，混合两个亚群细胞，即得。上述的一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法，其中，所述抗免疫抑制抗体是抗-程序性死亡受体1，调整所述抗-程序性死亡受体1在培养液A中的浓度为5-30微克/毫升即可。上述的一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法，其中，所述抗免疫抑制抗体是抗-细胞毒T淋巴细胞相关抗原4，调整所述抗-细胞毒T淋巴细胞相关抗原4在培养液A中的浓度为5-30微克/毫升即可。上述的一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法，其中，所述抗免疫抑制抗体是抗-T细胞免疫球蛋白黏蛋白3，调整所述抗-T细胞免疫球蛋白黏蛋白3在培养液A中的浓度为5-30微克/毫升即可。上述的一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法，其中，所述抗免疫抑制抗体是抗-程序性死亡受体1、抗-细胞毒T淋巴细胞相关抗原4、抗-T细胞免疫球蛋白黏蛋白3中的任意两种按体积比1:1组合而成，调整所述抗-程序性死亡受体1或抗-细胞毒T淋巴细胞相关抗原4或抗-T细胞免本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法，包括以下步骤：(1)抗原致敏及免疫抑制阻断：a、取体积比为100:2‑5的淋巴细胞培养基、胎牛血清混合，得淋巴细胞培养基、胎牛血清混合物；在淋巴细胞培养基、胎牛血清混合物中加入白细胞介素2，调整所述白细胞介素2在淋巴细胞培养基、胎牛血清混合物中的浓度为100‑1000单位/毫升，得培养液A，备用；b、取部分培养液A，加入非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞，调整培养液体积，使所述非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞在培养液A中的密度为1*106‑2*106个/毫升，培养12‑24小时；c、另取部分培养液A，加入抗免疫抑制抗体进行免疫抑制阻断，得培养液B，备用；d、将在培养液A中培养12‑24小时后得到的非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞全部吸出，转移至离心管中，离心3‑5分钟，离心力为300‑350g；离心完成后弃掉上层培养液；e、在离心完成后弃掉上层培养液的非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞中加入培养液B，调整所述非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞在培养液B中的浓度为0.5*106‑1*106个/毫升，培养24‑48小时后，加入细胞培养用常规人工合成肿瘤多肽，调整所述细胞培养用常规人工合成肿瘤多肽在所加入体系中的浓度为0.5‑1微克/毫升，继续培养24‑48小时，得非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞培养物；(2)T细胞亚群分离和刺激增殖：采用常规分选方法对非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞培养物进行亚群分选，得到CD4+、CD25‑辅助T细胞亚群和CD8+杀伤性T细胞亚群，将两个亚群分别置于X‑VIVO培养基中独立培养并加入激活试剂，培养密度为1*105‑1*107个/毫升，各组每隔3天进行半量换液，培养9‑12天后分别进行细胞计数；其中，CD4+、CD25‑辅助T细胞亚群的激活试剂为：CD3/CD28磁珠及白细胞介素7，调整所述CD3/CD28磁珠在所加入体系中为1‑5个/细胞、白细胞介素7的浓度为5‑20纳克/毫升；CD8+杀伤性T细胞亚群的激活试剂为：anti‑CD3、白细胞介素7及白细胞介素21，调整所述anti‑CD3在所加入体系中的浓度为5‑50纳克/毫升、白细胞介素7的浓度为2‑20纳克/毫升、白细胞介素21的浓度为1‑5纳克/毫升；(3)T细胞亚群的再刺激和快速增殖：上阶段培养结束后，加入经15‑35千戈瑞X射线辐照的外周血单个核细胞，所述外周血单个核细胞与CD4+、CD25‑辅助T细胞亚群和CD8+杀伤性T细胞亚群经培养9‑12天后所得细胞的数量比例为100‑500:1，加入细胞培养用常规人工合成肿瘤多肽，调整所述细胞培养用人工合成肿瘤多肽在所加入体系中的的浓度为0.5‑3微克/毫升，继续培养12‑15天，培养过程中控制培养密度为1*106‑2*106个/毫升；(4)收获：培养结束后，在CD4+、CD25‑辅助T细胞亚群和CD8+杀伤性T细胞亚群中分别取样培养细胞，进行微生物、内毒素、流式细胞学和细胞因子分泌分析后，混合两个亚群细胞，即得。...

【技术特征摘要】
1.一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法，包括以下步骤：(1)抗原致敏及免疫抑制阻断：a、取体积比为100:2-5的淋巴细胞培养基、胎牛血清混合，得淋巴细胞培养基、胎牛血清混合物；在淋巴细胞培养基、胎牛血清混合物中加入白细胞介素2，调整所述白细胞介素2在淋巴细胞培养基、胎牛血清混合物中的浓度为100-1000单位/毫升，得培养液A，备用；b、取部分培养液A，加入非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞，调整培养液体积，使所述非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞在培养液A中的密度为1*106-2*106个/毫升，培养12-24小时；c、另取部分培养液A，加入抗免疫抑制抗体进行免疫抑制阻断，得培养液B，备用；d、将在培养液A中培养12-24小时后得到的非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞全部吸出，转移至离心管中，离心3-5分钟，离心力为300-350g；离心完成后弃掉上层培养液；e、在离心完成后弃掉上层培养液的非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞中加入培养液B，调整所述非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞在培养液B中的浓度为0.5*106-1*106个/毫升，培养24-48小时后，加入细胞培养用常规人工合成肿瘤多肽，调整所述细胞培养用常规人工合成肿瘤多肽在所加入体系中的浓度为0.5-1微克/毫升，继续培养24-48小时，得非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞培养物；(2)T细胞亚群分离和刺激增殖：采用常规分选方法对非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞培养物进行亚群分选，得到CD4+、CD25-辅助T细胞亚群和CD8+杀伤性T细胞亚群，将两个亚群分别置于X-VIVO培养基中独立培养并加入激活试剂，培养密度为1*105-1*107个/毫升，各组每隔3天进行半量换液，培养9-12天后分别进行细胞计数；其中，CD4+、CD25-辅助T细胞亚群的激活试剂为：CD3/CD28磁珠及白细胞介素7，调整所述CD3/CD28磁珠在所加入体系中为1-5个/细胞、白细胞介素7的浓度为5-20纳克/毫升；CD8+杀伤性T细胞亚群的激活试剂为：anti-CD3、白细胞介素7及白细胞介素21，调整所述anti-CD3在所加入体系中的浓度为5-50纳克/毫升、白细胞介素7的浓度为2-20纳克/毫升、白细胞介素21的浓度为1-5纳克/毫升；(3)T细胞亚群的再刺激和快速增殖：上阶段培养结束后，加入经15-35千戈瑞X射线辐照的外周血单个核细胞，所述外周血单个核细胞与CD4+、CD25-辅助T细胞亚群和CD8+杀伤性T细胞亚群经培养9-12天后所得细胞的数量比例为100-500:1，加入细胞培养用常规人工合成肿瘤多肽，调整所述细胞培养用人工合成肿瘤多肽在所加入体系中的的浓度为0.5-3微克/毫升，继续培养12-15天，培养过程中控制培养密度为1*106-2*106个/毫升；(4)收获：培养结束后，在CD4+、CD25-辅助T细胞亚群和CD8+杀伤性T细胞亚群中分别取样培养细胞，进行微生物、内毒素、流式细胞学和细胞因子分泌分析后，混合两个亚群细胞，即得。2.如权利要求1所述的一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法，其中：所述抗免疫抑制抗体是抗-程序性死亡受体1，调整所述抗-程序性死亡受体1在培养液A中的浓度为5-30微克/毫升即可。3.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨远，修瑾，陈阶，唐景玲，
申请(专利权)人：贵州太瑞生诺生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：贵州,52