融合蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物医药领域，特别涉及融合蛋白及其制备方法和应用。本发明专利技术公开了一种可在纤维化肝脏中进行富集、并特异靶向肌成纤维细胞样肝星状细胞(MF‑HSCs)的IFNγ(Interferon gamma)作用活性的融合蛋白分子。经原核细胞表达和亲和纯化后，改造的IFNγ融合蛋白在ELISA检测中显示出对Ⅰ型胶原蛋白的高亲和性、显著抑制MF‑HSC细胞中MF表型分子标记基因的表达、并明显降低细胞中Ⅰ型胶原蛋白的产生。本发明专利技术蛋白特异性强、分子量小、易于制备，特别是具备对纤维化肝脏和活化肝星状细胞的双重靶向性，在包括肝纤维化在内的各类纤维化疾病的治疗中具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
融合蛋白及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物医药领域，特别涉及融合蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
肝纤维化是肝脏遭受多种损伤后的病理性修复反应，是大多数慢性肝病发展为肝硬化的必经阶段，其特点是肌成纤维细胞样(MF)细胞在肝组织内异常扩增和细胞外基质蛋白(ECM)过度沉积。肝星状细胞(HSCs)与肝纤维化密切相关。当肝脏受损伤时，静息态的HSC被激活成为快速增殖的MF表型细胞。这些扩增的MF-HSCs合成大量ECM蛋白(尤其是Ⅰ型胶原蛋白)并分泌基质金属蛋白酶抑制蛋白，引起ECM的重构和沉积，最终导致纤维化的发生。因此，MF-HSCs已成为治疗肝纤维化的重要靶标，已经先后有紫杉醇和苦参碱类等化合物用于抑制其增殖和细胞外基质ECM的沉积。作为一种抗增殖细胞因子，干扰素γ(IFNγ)可显著抑制成纤维细胞的增殖和降低胶原蛋白的产生，表现出良好的抗肝纤维化活性。其灵敏度高、作用效果好，在抑制肝纤维化中的作用受到越来越广泛的关注。然而IFNγ的半衰期段过短、缺乏靶向性作用，在系统性使用时常常产生严重的副作用，极大限制了其在肝纤维化治疗上的临床应用。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供一种融合蛋白及其制备方法和应用。该蛋白的ECM(尤其包括胶原蛋白)高亲和性由PlGF-2123-144结构域介导。其N-端连有GST蛋白以便纯化，C-端接有BiPPB(bicyclicPDGFβR-bindingpeptide)肽段用于对活化肝星状细胞表面PDGFβ受体的特异性识别。IFNγ的作用活性微区(mimIFNγ)则位于整个融合蛋白分子的C-端。经原核细胞表达和亲和纯化后，改造的IFNγ融合蛋白在ELISA检测中显示出对Ⅰ型胶原蛋白的高亲和性、显著抑制MF-HSC细胞中MF表型分子标记基因的表达、并明显降低细胞中Ⅰ型胶原蛋白的产生。本专利技术蛋白特异性强、分子量小、易于制备，特别是具备对纤维化肝脏和活化肝星状细胞的双重靶向性。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种融合蛋白，包括短肽和识别肽；所述短肽为人胎盘生长因子2中第123～144位氨基酸；所述识别肽为双环β血小板衍生生长因子受体识别肽。本专利技术还提供了一种融合蛋白，包括短肽、识别肽和IFNγ胞内信号传导结构域；所述短肽为人胎盘生长因子2中第123～144位氨基酸；所述识别肽为双环β血小板衍生生长因子受体识别肽。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述融合蛋白还包括GST蛋白。本专利技术公开了一种可在纤维化肝脏中进行富集、并特异靶向肌成纤维细胞样肝星状细胞(MF-HSCs)的IFNγ(Interferongamma)作用活性的融合蛋白分子。所述蛋白的ECM(尤其包括胶原蛋白)高亲和性由PlGF-2123-144结构域介导。其N-端连有GST蛋白以便纯化，C-端接有BiPPB(bicyclicPDGFβR-bindingpeptide)肽段用于对活化肝星状细胞表面PDGFβ受体的特异性识别。IFNγ的作用活性微区(mimIFNγ)则位于整个融合蛋白分子的C-端。经原核细胞表达和亲和纯化后，改造的IFNγ融合蛋白在ELISA检测中显示出对Ⅰ型胶原蛋白的高亲和性、显著抑制MF-HSC细胞中MF表型分子标记基因的表达、并明显降低细胞中Ⅰ型胶原蛋白的产生。本专利技术蛋白特异性强、分子量小、易于制备，特别是具备对纤维化肝脏和活化肝星状细胞的双重靶向性，在包括肝纤维化在内的各类纤维化疾病的治疗中具有良好的应用前景。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述具有如下所示的氨基酸序列中的任意一项：Ⅰ、具有SEQIDNO:9所示的氨基酸序列；Ⅱ、具有SEQIDNO:9所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列；III、与SEQIDNO:9所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的序列。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述修饰包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化或羰基化。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述取代为取代1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个氨基酸。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述缺失为缺失1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个氨基酸。所述添加为添加1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个氨基酸。本专利技术还提供了所述的融合蛋白在制备肝星状细胞活化的抑制剂和/或Ⅰ型胶原蛋白表达的抑制剂中的应用。本专利技术还提供了所述的融合蛋白在制备预防和/治疗纤维化疾病的药物中的应用。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述纤维化疾病为肝纤维化。本专利技术还提供了所述的融合蛋白在制备预防和/治疗肝硬化或肝癌的药物中的应用。本专利技术还提供了一种编码所述融合蛋白的DNA分子，包括编码所述短肽的第二区核苷酸、编码所述识别肽的第三区核苷酸。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述DNA分子还包括编码所述IFNγ胞内信号传导结构域的第四区核苷酸。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述DNA分子还包括编码GST蛋白的第一区核苷酸。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述DNA分子在所述第二区核苷酸和所述第三区核苷酸之间还包括6个甘氨酸的连接子。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述DNA分子具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：Ⅰ、具有SEQIDNO:10所示的核苷酸序列；Ⅱ、具有SEQIDNO:10所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；III、与SEQIDNO:10所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；IV、如Ⅰ、Ⅱ或III所示序列的互补序列。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述取代为取代1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合蛋白，其特征在于，包括短肽和识别肽；所述短肽为人胎盘生长因子2中第123～144位氨基酸；所述识别肽为双环β血小板衍生生长因子受体识别肽。

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征在于，包括短肽和识别肽；所述短肽为人胎盘生长因子2中第123～144位氨基酸；所述识别肽为双环β血小板衍生生长因子受体识别肽。2.根据权利要求1所述的融合蛋白在制备纤维化组织的高亲和性药物和/或特异性结合肝星状细胞的药物中的应用。3.一种融合蛋白，其特征在于，包括短肽、识别肽和IFNγ胞内信号传导结构域；所述短肽为人胎盘生长因子2中第123～144位氨基酸；所述识别肽为双环β血小板衍生生长因子受体识别肽。4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，具有如下所示的氨基酸序列中的任意一项：Ⅰ、具有SEQIDNO:9所示的氨基酸序列；Ⅱ、具有SEQIDNO:9所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列；III、与SEQIDNO:9所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的序列。5.根据权利要求3或4所述的融合蛋白在制备肝星状细胞活化的抑制剂和/或Ⅰ型胶原蛋白表达的抑制剂中的应用。6.根据权利要求3或4所述的融合蛋白在制备预防和/治疗纤维化疾病的药物中的应用。7.根据权利要求3或4所述的融合蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈渝萍，董育红，华慧，
申请(专利权)人：南华大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43