分离的抗体或其抗原结合片段及其在肿瘤治疗中的应用制造技术

本发明专利技术提出了一种分离的抗体或其抗原结合片段。该分离的抗体或其抗原结合片段可用于制备治疗肿瘤的药物。

【技术实现步骤摘要】
分离的抗体或其抗原结合片段及其在肿瘤治疗中的应用
本专利技术涉及一种抗体，尤其涉及分离的抗体或其抗原结合片段及其在肿瘤治疗中的应用。
技术介绍
人OX40是一个277aa的蛋白，但由于其在N146和N160位的糖基化，其表观分子量约为50kD[1,2]。OX40是一个I型穿膜蛋白，其胞外区段可与其天然配体OX40L(CD252)结合，胞内区段则与T细胞活化的多个信号通路相偶联。人OX40主要表达于活化的T细胞上，包括CD4、CD8、Th和Treg细胞等(reviewedin[3])。在T细胞上OX40的表达很低，但是经过抗原诱导刺激后其表达水平上调并在12h至5-6天内达到峰值。类似的，OX40L的表达也受到细胞活化状态的影响[3]。APC细胞在抗原刺激后1-3天可以检测到OX40L的表达。有趣的是，除了免疫细胞外，肌肉细胞在炎症因子的刺激下也会表达OX40L[4,5]，提示OX40L-OX40信号通路可能广泛作用于机体的炎症反应。基于OX40/OX40L主要表达于抗原激活的T细胞的特点，开发OX40激动剂有望成为一种特异性强、副作用低的免疫疗法。抗原依赖的OX40L/OX40共刺激分子的活化与T细胞内多个信号通路相偶联。晶体结构研究表明，OX40L与OX40的结合可诱导OX40-OX40L复合物三聚体化[6]，从而在胞内形成与receptor-associatedfactor(TRAF)的结合位点。后者(TRAF2、5)则可进而激活NF-κB信号通路，抑制T细胞凋亡[5,7,8]。有研究发现，OX40活化可以导致Bcl-2和Bcl-xL高表达[9]，提示OX40可能通过NF-κB信号通路诱导抗凋亡蛋白表达而实现其抑制T细胞凋亡的功能。PKB/PI3K是OX40下游的另一个重要信号通路。研究发现，一方面，T细胞上OX40的共刺激信号是维持PKB活化的必要条件，另一方面，组成型活化的PKB可以拮抗OX40缺陷导致的T细胞中抗凋亡蛋白的下调[10]。OX40共刺激信号可以通过PKB/PI3K信号通路维持Survivin的表达[11]。最后，T细胞上TCR和OX40的活化还可以协同引起钙流和NFAT信号通路的活化，调节包括IL-2、IL-4、IL-5和IFN-γ在内的细胞因子的表达[12]。综上，上述研究表明OX40的活化可以通过NF-κB信号通路、PKB/PI3K信号通路和NFAT信号通路来调节T细胞的增殖、凋亡和细胞因子分泌活性，从而达到增强免疫系统活力的效果。但是对OX40的更深入的研究发现，CD4+细胞中Treg细胞亚群也会表达OX40。OX40在小鼠Treg细胞上持续表达，而人Treg细胞则是在活化后呈上调表达[13,14]。Treg是一类对效应T细胞(Teff)有抑制作用的细胞，因此研究OX40在Treg细胞上的功能是一个十分有趣的问题。现有的证据显示OX40信号通路对于natureTreg(nTreg)的发育影响不大，而大多数研究表明其对inducedTreg(iTreg)的发育则有较明确的抑制性调节作用(reviewedin[3,15])。与在Treg细胞发育中结论较明确不同的是，关于OX40信号通路对Treg细胞功能的调节作用的研究则不尽一致。一些研究表明OX40信号通路可以抑制Treg细胞的免疫抑制功能[14,16-20]；而另一些则发现OX40对于Treg细胞充分发挥其免疫抑制功能是必须的[21-23]。这种不一致可能与不同实验室采用的不同实验模型和实验条件相关，也提示OX40在机体内对Treg细胞的功能可能受到不同生理、病理条件的影响。类似的，OX40活性对Treg细胞增殖和凋亡的影响也随细胞所处的微环境不同而不同。例如在没有IFN-γ和IL-4存在[24]或是有FoxP3表达[17]的情况下，激活OX40可以明显促进Treg细胞的扩增。而在另一些情况下，则没有观察到这种OX40依赖的Treg扩增[14]。综上，OX40对免疫系统的调控作用是一个复杂的过程。一方面，OX40共刺激信号在某些情况下可以通过增强效应T细胞活性和抑制Treg功能的双重机制达到免疫激活的效果；另一方面，OX40信号通路也可能促进Treg细胞的增殖，拮抗效应T细胞的功能；此外，ADCC的作用机制既能清除Teff细胞也能清除负调控的Treg细胞。肿瘤浸润淋巴细胞(tumorinfiltratinglymphocytes,TIL)是外周淋巴系统迁移并滞留在肿瘤组织内部的淋巴细胞，其数量及类型往往与病人的预后相关[25,26]。许多研究表明OX40在肿瘤浸润淋巴细胞上，特别是Treg上呈高表达[27-32]，这很可能是肿瘤特异抗原激活了T细胞的一种表现。在淋巴瘤中，由于OX40在Treg上的高度上调，OX40甚至可以作为抗原特异的Treg的生物标志物[30]。有趣的是，OX40的表达与肿瘤病人的临床预后相关。在结肠癌中，TIL、肠系膜淋巴结或肿瘤边缘的淋巴集结上OX40的高表达与较长的生存期相关[31]。类似的，在黑色素瘤病人中，TIL和肿瘤周边淋巴细胞中OX40阳性细胞的数量与肿瘤的转移和病人的生存期相关[32]。基于上述发现，以及OX40在T细胞活化中的重要作用，OX40成为肿瘤治疗的一个重要靶点。OX40信号通路的活化可以通过使用激活性OX40抗体或是与OX40L融合蛋白结合等方式来实现。最早的使用OX40激动剂进行肿瘤治疗的尝试可以追溯到2000年，Weinberg实验室报道了腹腔给予OX40L:Ig融合蛋白可以阻止皮下移植瘤的成瘤[33]。有趣的是，治疗组小鼠对于再次接种同样的肿瘤仍然有很好的免疫力，而对接种不同的肿瘤细胞则没有类似的免疫力[33]。这个结果提示OX40激动剂在肿瘤治疗过程中可以增强肿瘤特异的记忆T细胞反应。同时，研究还表明CD4+和CD8+细胞对于OX40激动剂的抗肿瘤活性都是必须的[33,34]。在此之后众多的临床前研究都证明了在动物模型上单独使用OX40激动剂或是与其它肿瘤治疗手段联用可以有效抑制肿瘤生长甚至预防肿瘤复发(reviewedin[15,35])。主要参考文献：1.MallettS,FossumS,BarclayAN.CharacterizationoftheMRCOX40antigenofactivatedCD4positiveTlymphocytes--amoleculerelatedtonervegrowthfactorreceptor.EMBOJ.1990；9:1063-8.doi:2.ByunM,MaCS,AkcayA,PedergnanaV,PalendiraU,MyoungJ,AveryDT,LiuY,AbhyankarA,LorenzoL,SchmidtM,LimHK,CassarO,etal.InheritedhumanOX40deficiencyunderlyingclassicKaposisarcomaofchildhood.JExpMed.2013；210:1743-59.doi:10.1084/jem.20130592.3.WilloughbyJ,GriffithsJ,TewsI,CraggMS.OX40:Structureandfu本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区选自以下序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11中的一个或多个。

【技术特征摘要】
1.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区选自以下序列：SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：7、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10和SEQIDNO：11中的一个或多个。2.根据权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区为：SEQIDNO：1、SEQIDNO：2和/或SEQIDNO：3；SEQIDNO：1、SEQIDNO：7和/或SEQIDNO：3；或SEQIDNO：9、SEQIDNO：10和/或SEQIDNO：11。3.根据权利要求1或2所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述轻链可变区选自以下序列：SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：8、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13和SEQIDNO：14中的一个或多个。4.根据权利要求3所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述轻链可变区为：SEQIDNO：4、SEQIDNO：5和/或SEQIDNO：6；SEQIDNO：4、SEQIDNO：5和/或SEQIDNO：8；或SEQIDNO：12、SEQIDNO：13和/或SEQIDNO：14。5.根据权利要求4所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，重链可变区包括SEQIDNO：1、SEQIDNO：2和SEQIDNO：3；轻链可变区包括：SEQIDNO：4、SEQIDNO：5和SEQIDNO：6；重链可变区包括SEQIDNO：1、SEQIDNO：7和SEQIDNO：3；轻链可变区包括：SEQIDNO：4、SEQIDNO：5和SEQIDNO：6；重链可变区包括SEQIDNO：1、SEQIDNO：2和SEQIDNO：3；轻链可变区包括：SEQIDNO：4、SEQIDNO：5和SEQIDNO：8；重链可变区包括SEQIDNO：1、SEQIDNO：7和SEQIDNO：3；轻链可变区包括：SEQIDNO：4、SEQIDNO：5和SEQIDNO：8；或重链可变区包括SEQIDNO：9、SEQIDNO：10和SEQIDNO：11；轻链可变区包括：SEQIDNO：12、SEQIDNO：13和SEQIDNO：14。6.根据权利要求1-5之任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区替换为以下序列：SEQIDNO：15、SEQIDNO：17、SEQIDNO：19。7.根据权利要求6所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述轻链...

【专利技术属性】
技术研发人员：殷迅，赵静，
申请(专利权)人：南京优迈生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32