基于SSR标记的国槐DNA指纹图谱库及其构建方法技术

技术编号:18281808 阅读:258 留言:0更新日期:2018-06-23 21:49
本发明专利技术公开了一种基于SSR标记的国槐DNA指纹图谱库及其构建方法,属于检测领域领域。国槐DNA指纹图谱库,是根据国槐品种基因组DNA和筛选的SSR引物序列构建得到;本发明专利技术利用SSR分子标记技术对部分国槐的遗传多样性进行分析的基础上进行构建,其研究结果将对国槐种质资源的鉴定、评价、优良杂交组合选配和杂种早期筛选提供科学依据,此外,本发明专利技术国槐DNA指纹图谱库鉴别国槐品种具有重复性好、稳定可靠、检测快速的优点,且不受时空条件的限制。

【技术实现步骤摘要】
基于SSR标记的国槐DNA指纹图谱库及其构建方法
本专利技术涉及指纹图谱库及其构建方法,具体涉及一种国槐DNA指纹图谱库及其构建方法。
技术介绍
国槐SophorajaponicaL.又名家槐、中国槐、槐米树等,属于豆科Leguminosaesp.槐属SophoraL.,落叶乔木,树高可达到25米。原产地在我国北方,在我国有着深远的栽培历史,早在秦汉时期,就已经有关于通道上夹路植槐的记载。国槐属于阳性树种,稍耐荫,对土壤的要求并不严格,根系发达、生长快、移栽成活率高、适应能力强,此外还具有抗污染,耐烟尘,抗风等特点,能够极好的适应城市街道环境。国槐对氯化氢、氯气、二氧化硫等许多有毒气体都有着较强的吸收及富集作用。国槐枝叶繁茂,夏秋可观花观叶,这也使其能够成为城市良好的遮荫树种和行道树。此外,国槐在材用、药用、食用等方面也具有重要的作用。目前关于国槐的研究还主要集中于繁殖技术、遗传转化以及种子表型性状的变异等方面。SSR(SimpleSequenceRepeats)简单序列重复,又被称为微卫星标记,是将特异引物PCR作为基础的最重要的分子标记之一。SSR是指通常由几个(一般为1~6个)核苷酸组成的基因组内的基本单位经过PCR扩增,多次重复构成的一段DNA片段,在基因组内的不同位置都广泛,长度通常在200bp以下。用于SSR标记的引物是以微卫星重复序列两翼的特定短序列为根据来设计的,作用是对重复序列本身进行扩增。扩增后的重复序列的长度会有很大变化,所以这就成为基因多态性检测的一种行之有效方法。在植物群体中,微卫星序列具有较高的多态性,且通常为共显性,能够非常好的鉴别出纯合子和杂合子。遗传多样性是生物多样性的基础,群体的遗传多样性的分布在很大程度上受到迁移、突变和天择等众多因素的影响,基因频率在一定的程度上会发生波动,即遗传多样性能够在DNA水平上呈现出来。SSR分子标记技术是对DNA水平上遗传多样性的反映,能够反映生物种群间或个体间基因组中存在差异的特异性片段。SSR分子标记技术具有多态性高、数量丰富、在遗传上呈共显性、实验方法简单、结果稳定可靠等诸多优点,在进行亲缘关系鉴定、标记辅助选择、品种鉴别和真实性及纯度鉴定、遗传图谱的构建等方面都具有重要的研究及应用价值,是目前较为理想的一种分子标记。目前,针对国槐指纹图谱数据库的构建报道较少,《国槐种子形态变异与品种/无性系SRAP分子识别研究》中通过SRAP标记筛选12对引物Em9-Me12,构建SRAP指纹图谱,将国槐10个品种及23份无性系品种区分开来,但是国槐品种中聊红槐仍是鉴别不出,其鉴定品种有限且灵敏度不高,因此,亟待构建一种灵敏度高的指纹图谱库来区别鉴定国槐的不同品种。
技术实现思路
针对上述问题,本专利技术利用SSR分子标记技术对部分国槐的遗传多样性进行分析,在此基础上构建国槐SSR指纹图谱库,其研究结果将对国槐种质资源的鉴定、评价、优良杂交组合选配和杂种早期筛选提供科学依据。本专利技术的第一个目的在于提供国槐DNA指纹图谱库,为从DNA水平鉴定国槐品种提供依据;本专利技术的另一目的在于提供上述国槐品种标准DNA指纹图谱库的构建方法。本专利技术的目的是这样实现的:本专利技术的国槐SSR标记指纹图谱的构建方法,包括16对筛选出的SSR标记引物,筛选出的16对引物扩增条带清晰,多态性好,扩增结果稳定。所述16对SSR引物对序列见表1:表116对国槐SSR引物序列利用已建立好的国槐SSR反应体系(表3-4),从100对引物中进行三次筛选,第一次将扩增出条带的引物保留,不能扩增出条带的引物在调整扩增体系仍不能扩增出条带时丢弃,第二次将扩增条带清晰的引物保留,通过调整体系仍扩增不出清晰条带的引物丢弃,第三次将扩增多样性好的引物保留,根据此程序筛选出16对条带清晰,稳定性强,多态性好的引物。上述所述国槐DNA指纹图谱库的构建方法,具体包括如下步骤:(1)国槐各品种基因组DNA提取:采用改良的CTAB法进行提取;所述国槐品种DNA来自下表所述的国槐品种,见表2(2)SSR标记的PCR扩增:用筛选出的16对SSR引物对上述提取的DNA进行PCR扩增;(3)毛细管电泳检测;表2供试的233份国槐古树种质优选的,所述的步骤(1)中改良的CTAB法提取基因组DNA,具体步骤如下:a.65℃预热DNA提取缓冲液2×CTAB700μL,β-巯基乙醇20μL,10%PVP140μL,充分混匀。b.称取0.5g幼嫩国槐叶片,装入2mL离心管中,加入直径约为2mm的钢珠两粒,放入装有液氮的盒子中冷冻约15秒,用retsch混合型研磨仪研磨约1.5min,至国槐叶片呈细粉末状,向每个离心管中迅速加入预热的CTAB700μL,然后放入65℃水浴锅中水浴30min左右,水浴过程中要注意轻微翻转离心管2-3次。c.水浴后冷却至室温,加入等体积的酚:氯仿:异戊醇,温和翻转至充分混合均匀,室温12000rpm离心10min。d.吸取上清液转入新的离心管中,加入等体积的氯仿:异戊醇,温和翻转至充分混合均匀,室温12000rpm离心10min。e.吸取上清液于新的离心管中,并加入2倍体积-20℃预冷的的异丙醇或无水乙醇,于-20℃静放30min-1h。f.用枪头或者牙签挑取出每个样品中的絮状DNA沉淀,用1mL75%的乙醇和无水乙醇洗涤2-3次,置于通风处吹干。g.加60μLddH2O溶解DNA,-20℃保存待用。所述步骤(a)中DNA提取缓冲液2×CTAB包括100mMTris-HCl(PH8.0),1.4mMNaCl,50MmEDTA(PH8.0),2%CTAB;进一步,优选的,所述的步骤(c)中酚、氯仿、异戊醇的体积比为25:24:1;进一步,优选的,所述的步骤(d)中氯仿、异戊醇体积比为24:1;优选的,所述的步骤(2)中SSR-PCR反应体系见表3表3SSR-PCR国槐反应体系的组成优选的,所述的步骤(2)中SSR-PCR反应程序采用采用touch-down程序,具体如表4:表4PCR扩增反应程序本专利技术采用touch-down程序是为了有效避开确定最佳退火温度而进行的复杂的反应优化过程。Touch-downPCR程序每循环降低0.5℃都会造成每个循环PCR产物量的较大差异,相对于非正确产物,正确的产物可以得到富集。优选的,所述的步骤(3)中毛细管电泳检测,用16对筛选出的已标记不同荧光的引物进行PCR扩增,在96孔上样板的每个孔中分别加PCR产物、甲酰胺和GS-500LIZ分子量内标混匀,离心,变性,4℃冷却后离心,DNA测序仪ABI3730xlDNAanalyzer(Appliedbiosystems,FosterCity,USA)进行自动荧光检测。利用Gene-Marker2.2.0软件(SoftGeneticsLLC,USA)读取结果,并记录每个位点片段大小。进一步,优选的,所述PCR产物、甲酰胺、GS-500LIZ分子量内标的用量比为0.3μL:9.5μL:0.5μL;进一步,优选的,所述变性为95℃变性5min。通过上述方法所构建的国槐SSR指纹图谱库见实施例结果分析中表7。本专利技术所述构建方法在国槐种质资源的鉴定、评价、优良杂交组合选配和杂种早期筛选中的应用。本专利技术国槐SSR指纹图谱库本文档来自技高网
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基于SSR标记的国槐DNA指纹图谱库及其构建方法

【技术保护点】
1.基于SSR标记的国槐DNA指纹图谱库的构建方法,其特征在于,包括16对筛选的SSR标记引物,所示序列为SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:32。

【技术特征摘要】
1.基于SSR标记的国槐DNA指纹图谱库的构建方法,其特征在于,包括16对筛选的SSR标记引物,所示序列为SEQIDNO:1~SEQIDNO:32。2.如权利要求1所述的构建方法,具体包括如下步骤:(1)国槐各品种基因组DNA提取:采用改良的CTAB法进行提取;(2)SSR标记的PCR扩增:用筛选出的16对SSR引物对上述提取的DNA进行PCR扩增;(3)毛细管电泳检测。3.如权利要求3所述的构建方法,其特征在于,所述步骤(1)中改良的CTAB法提取基因组DNA,具体步骤如下:a.65℃预热DNA提取缓冲液2×CTAB700μL,β-巯基乙醇20μL,10%PVP140μL,充分混匀。b.称取0.5g幼嫩国槐叶片,装入2mL离心管中,加入直径约为2mm的钢珠两粒,放入装有液氮的盒子中冷冻约15秒,用retsch混合型研磨仪研磨约1.5min,至国槐叶片呈细粉末状,向每个离心管中迅速加入预热的CTAB700μL,然后放入65℃水浴锅中水浴30min左右,水浴过程中要注意轻微翻转离心管2-3次。c.水浴后冷却至室温,加入等体积的酚:氯仿:异戊醇,温和翻转至充分混合均匀,室温12000rpm离心10min。d.吸取上清液转入新的离心管中,加入等体积的氯仿:异戊醇,温和翻转至充分混合均匀,室温12000rpm离心10min。e.吸取上清液于新的离心管中,并加入2倍体积-20℃预冷的的异丙醇或无水乙醇,于-20℃静放30min-1h。f.用枪头或者牙签挑取出每个样品中的絮状DNA沉淀,用1mL75%的乙醇和无水乙醇洗涤2-3次,置于通风处吹干。g.加60μLddH2O溶解DNA,-20℃保存待用。4.如权利要求3所述的构建方法,其特征在于,所述步骤(a)中DNA提取缓冲液2×CTAB包括100...

【专利技术属性】
技术研发人员:庞彩红夏阳李双云张明静杨勇刘盛芳臧真荣付茵茵李自峰王守国亓玉昆
申请(专利权)人:山东省林业科学研究院
类型:发明
国别省市:山东,37

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