SFN联合IL-15和IL-21制备记忆性T细胞的方法及应用技术

本发明专利技术涉及临床免疫细胞技术领域，尤其是一种SFN联合IL‑15和IL‑21制备记忆性T细胞的方法及应用，包括以下步骤：(1)采集人外周血，采用密度梯度离心法获得人外周血单个核细胞；(2)采用磁分选仪分选CD8+T细胞；(3)将分选的CD8+T细胞加入含有刺激剂CD3/CD28beads、细胞因子IL‑15、IL‑21和SFN的培养基中培养；(4)扩增至7d时即可获得具有大量具有记忆性前体细胞表型的CD8+T细胞。本方法可使记忆性T细胞在体外培养中获得大量扩增，解决目前临床培养技术瓶颈，增强免疫细胞持久高效的抗肿瘤活性力，为细胞免疫治疗进一步临床应用提供可行性治疗手段。

【技术实现步骤摘要】
SFN联合IL-15和IL-21制备记忆性T细胞的方法及应用
本专利技术涉及临床免疫细胞
，具体领域为一种记忆性T细胞的制备方法。
技术介绍
T细胞作为参与适应性免疫的主力军，在机体免疫反应中扮演着重要的角色，是目前癌症免疫治疗的研究热点。作为细胞治疗的重要组成部分，过继性免疫细胞治疗是指将体外培养的免疫效应细胞输注给患者，以杀伤患者体内的肿瘤细胞。研究发现：记忆性T细胞在体内的增殖能力和抗肿瘤活性，均优于效应记忆性T细胞和效应性T细胞，此外，记忆性T细胞对维持机体免疫内环境的稳态及重建具有重大意义。这意味着，记忆性T细胞在体内存活的时间越长，其抗肿瘤的临床效果越强。然而细胞的体外培养面临着巨大的挑战即体外培养的免疫细胞处于终末分化状态，这提示T细胞在体内存活时间短、抗肿瘤效果差等问题。基于此点，如何在体外诱导培养并获得更多的分化程度低、抗肿瘤活性强的免疫细胞，是目前免疫治疗研究关注的热点。细胞因子的不同生物学特性及可能对T细胞分化的影响，成为细胞特异性的体外诱导及增强T细胞杀伤活性的突破点。IL-15由单核-巨噬细胞分泌的细胞因子，具有强大的抗病毒、抗细菌感染作用。其功能和IL-2相似，在免疫反应中起着重要的作用。有文献报道，IL-15对CD8+T细胞的生存和分化有影响，在细胞contraction期与IL-2的协同作用可延长KLRG1hiCD8+T细胞的生存时间，并增强其向记忆性前体细胞的分化。AngelaM等报道了CD127影响T细胞分化命运和功能。记忆性前体细胞均高表达CD127，而效应性T细胞及终末分化T细胞表型为CD127-。已有文献报道记忆性前体T细胞表达较高水平的CD127和较低水平的KLRG1。IL-21通过诱导T细胞早期分化的表型对记忆性T细胞的维持和发育起到重要作用。同时，IL-21诱导记忆性T细胞产生的方法，已经应用于临床免疫细胞培养体系中。此外，T细胞的分化受到一些关键信号通路的调控，已有文献报道抑制mTOR及其下游信号通路能够促进记忆T细胞分化。在T细胞分化的研究中我们发现，SFN能够下调哺乳动物雷帕霉素靶点(mammaliantargetofrapamycin，mTOR)及其下游通路p-S6，促进低分化记忆性T细胞的形成，同时抑制抗凋亡基因BcL2的分泌及降低T细胞表面抑制性标志物PD-1的表达。综上所述，多种细胞因子的组合应用为ACT治疗提供更多的分化低、抗瘤活性强的T细胞。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种SFN联合IL-15和IL-21制备记忆性T细胞的方法及应用，，获得大量具有记忆特性同时分化状态低的T细胞用于肿瘤的治疗，以解决现有技术中临床培养T细胞的技术瓶颈。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种SFN联合IL-15和IL-21制备记忆性T细胞的方法，包括以下步骤：(1)采集人外周血，采用密度梯度离心法获得人外周血单个核细胞；(2)采用磁分选仪分选CD8+T细胞；(3)将分选的CD8+T细胞加入含有刺激剂CD3/CD28beads、细胞因子IL-15、IL-21和SFN的培养基中培养；(4)扩增至7d时即可获得具有大量具有记忆性前体细胞表型的CD8+T细胞。优选的，步骤(1)中获得人外周血单个核细胞具体的方法为，在无菌条件下采集人外周血，先在1500rpm，10min条件下离心，将血清转移至无菌的离心管中56℃灭活25min，再4000rpm，20min离心血清，用缓冲液稀释沉淀的血细胞，然后将血细胞稀释液缓慢的加至淋巴分离液上，2500rpm，25min条件下离心，最后吸取白膜层，并用PBS缓冲液清洗，1500rpm，10min离心，弃上清后采用PBS缓冲液清洗，1500rpm，5min离心，即获得人外周血单个核细胞。优选的，所述用PBS缓冲液稀释沉淀的血细胞时，采用1/2-1/4血细胞量的PBS缓冲液稀释，所述淋巴分离液的体积量为血细胞稀释液体积量的1/2-1/4。优选的，步骤(2)中用磁分选仪分选CD8+T细胞的方法为，按照每1×107个单个核细胞避光加入20μLhumanCD8microbeads和70μLautoMACSRunningBuffer，进行磁分选CD8+T细胞。优选的，步骤(3)中刺激剂CD3/CD28beads与CD8+T细胞比例为1:3，细胞因子IL-7的浓度为10ng/mL，IL-15的浓度为10ng/mL。SFN的浓度为20μM/mL。优选的，步骤(3)中所述培养基为TakaraGT-551培养基，培养条件为37℃、5％CO2环境。优选的，步骤(3)中所述培养基中还包括5％体积量的自体血清、青霉素和链霉素，培养基中T细胞密度为2×106/mL。本专利技术采用上述任一方法获得的人记忆性CD8+T细胞。本专利技术所述的人记忆性CD8+T细胞应用于制备治疗肿瘤疾病的制剂中。与现有技术相比，采用本专利技术的方法制备人记忆性CD8+T细胞，具有以下优点：(1)在体外实验中，从外周血中获得CD8+T细胞，加入CD3/CD28beads活化，并采用IL-15、IL-21和SFN处理。发现其促进记忆性前体的产生，同时下调Bcl2基因的表达，增强T细胞的抗凋亡能力。T细胞表面抑制性标志物PD-1分泌显著减低。(2)通过本方法可以获得大量具有记忆特性且分化状态低的记忆性T细胞，从而获得抗肿瘤活性高、体内存活时间长的T细胞用于临床过继性细胞免疫治疗。(3)本方法可使记忆性T细胞在体外培养中获得大量扩增，解决目前临床培养技术瓶颈，增强免疫细胞持久高效的抗肿瘤活性力，为细胞免疫治疗进一步临床应用提供可行性治疗手段。附图说明图1为对比例1、对比例2和对比例3与实施例1制备的流式检测外周血记忆性T细胞标志物CD127流式图；图2为对比例1、对比例2和对比例3与实施例1制备的流式检测外周血记忆性T细胞标志物KLRG1流式图；图3为对比例与实施例1制备的记忆性T细胞标志物CD127细胞比例统计图；图4为对比例与实施例1制备的记忆性T细胞标志物KLRG1细胞比例统计图；图5为RT-PCR检测外周血记忆性T细胞抗凋亡基因BcL2统计图；图6对比例与实施例1制备的记忆性T细胞表面抑制性标志物PD-1比例统计图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1无菌条件下采集外周血20mL采用密度梯度离心法获得人外周血单个核细胞PBMCs，具体步骤如下：先1500rpm，10min离心，其升速和减速的加速度均为9m/s2，将血清转移至无菌的50mL离心管中，56℃灭活25min，再4000rpm，20min离心血清，其升速和减速的加速度均为9m/s2。采用PBS缓冲液按照与血细胞量1:3的比例稀释沉淀的血细胞，然后将血细胞稀释液缓慢的加至淋巴分离液上，所述淋巴分离液的体积量为血细胞稀释液体积量的1/3。最后2500rpm，25min离心，其升速和减速的加速度均为5m/s2，小心吸取白膜层，用PBS缓冲液清洗两遍，1500rpm，10m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种SFN联合IL‑15和IL‑21制备记忆性T细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采集人外周血，采用密度梯度离心法获得人外周血单个核细胞；(2)采用磁分选仪分选CD8+T细胞；(3)将分选的CD8+T细胞加入含有刺激剂CD3/CD28 beads、细胞因子IL‑15、IL‑21和SFN的培养基中培养；(4)扩增至7d时即可获得具有大量具有记忆性前体细胞表型的CD8+T细胞。

【技术特征摘要】
1.一种SFN联合IL-15和IL-21制备记忆性T细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采集人外周血，采用密度梯度离心法获得人外周血单个核细胞；(2)采用磁分选仪分选CD8+T细胞；(3)将分选的CD8+T细胞加入含有刺激剂CD3/CD28beads、细胞因子IL-15、IL-21和SFN的培养基中培养；(4)扩增至7d时即可获得具有大量具有记忆性前体细胞表型的CD8+T细胞。2.根据权利要求1所述的SFN联合IL-15和IL-21制备记忆性T细胞的方法，其特征在于：所述步骤(1)中获得人外周血单个核细胞具体的方法为，在无菌条件下采集人外周血，先在1500rpm，10min条件下离心，将血清转移至无菌的离心管中56℃灭活25min，再4000rpm，20min离心血清，用PBS缓冲液稀释沉淀的血细胞，然后将血细胞稀释液缓慢的加至淋巴分离液上，2500rpm，25min条件下离心，最后吸取白膜层，并用PBS缓冲液清洗，1500rpm，10min离心，弃上清后采用PBS缓冲液清洗，1500rpm，5min离心，即获得人外周血单个核细胞。3.根据权利要求2所述的SFN联合IL-15和IL-21制备记忆性T细胞的方法，其特征在于：用PBS缓冲液稀释沉淀的血细胞时，采用1/2-1/4血细胞量的PBS缓冲液稀释，所述淋巴...

【专利技术属性】
技术研发人员：李红，张震，张毅，
申请(专利权)人：郑州大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：河南,41