小麦矮秆基因Rht12紧密连锁的KASP标记及其应用制造技术

本发明专利技术属于分子遗传育种领域，公开一种小麦矮秆基因Rht12紧密连锁的分子标记。本发明专利技术通过分子标记方法确定矮秆基因Rht12位于小麦5AL染色体末端，与分子标记5A‑6774933连锁，遗传距离为0.4cM，可作为小麦矮秆基因Rht12辅助选择的分子标记。本发明专利技术还公开了该分子标记对应的引物序列及利用KASP技术检测该标记的流程。利用该分子标记可以在分子水平上快速筛选小麦后代群体中含有矮秆基因Rht12的个体，准确性高，大大提高了矮化育种效率。

KASP markers linked tightly to wheat dwarf gene Rht12 and their application

The invention belongs to the field of molecular genetics and breeding, and discloses a molecular marker closely linked to wheat dwarf gene Rht12. The present invention determines that the dwarf gene Rht12 is located at the end of the wheat 5AL chromosome by molecular marker method, which is linked to the molecular marker 5A 6774933, and the genetic distance is 0.4cM, which can be used as a molecular marker for the auxiliary selection of the wheat dwarf gene Rht12. The invention also discloses the corresponding primer sequence of the molecular marker and the process of detecting the mark using KASP technology. The molecular markers can be used to quickly screen the individuals of dwarf gene Rht12 in wheat progeny, which has high accuracy and greatly improves the efficiency of dwarfing breeding.

【技术实现步骤摘要】
小麦矮秆基因Rht12紧密连锁的KASP标记及其应用
本专利技术属于植物分子遗传育种
，特别涉及小麦矮秆基因Rht12紧密连锁的KASP标记及其应用，以及筛选具有矮秆基因Rht12的小麦材料的方法。
技术介绍
小麦是全球性的重要粮食作物，全世界约有40％的人口以小麦为主食。矮化育种是获得小麦高产的重要途径，20世纪60年代，矮秆基因(Rht1和Rht2)引入小麦生产，显著提高了小麦的抗倒伏性和耐高肥水能力，使世界小麦产量大幅提升，并引发了第一次“绿色革命”，为解决粮食安全问题做出了巨大贡献。然而，当前小麦生产上应用的矮秆基因仍以Rht1、Rht2为主，据统计，世界上推广的小麦品种，约有70％至少携带Rht1或Rht2中的一个(RebetzkeGJ,EllisMH,BonnettDG,CondonAG,FalkD,RichardsRA.2011.TheRht13dwarfinggenereducespedunclelengthandplantheighttoincreasegrainnumberandyieldofwheat.FieldCropsResearch,124(31):323-331)。我国小麦品种主要含矮秆基因Rht1、Rht2和Rht8，三者分布频率约为23.6～45.0％、18.6～42.6％、41.8～56.6％(张晓科，中国小麦矮秆基因和春化基因分布及小麦品质相关性状多重PCR体系建立，博士后研究工作报告，中国农业科学院，2007；唐娜等，矮秆基因对小麦部分农艺性状的效应，西北植物学报，2010，30(1)：41-49)。矮秆基因在我国小麦品种中的分布特点可能与所用矮源和遗传背景有关。我国小麦中Rht1矮源主要来自农林10和郑引4号；Rht2主要来自农林10号、水源86、辉县红和蚰包麦；Rht8则主要来自阿夫、阿勃、中农28、郑引1号等。小麦矮秆基因的单一性，不仅限制了小麦产量的进一步提升，还使育成品种的遗传基础日益狭窄，遗传多样性降低，不利于小麦的可持续发展。近期研究发现，Rht1和Rht2在降低株高的同时，会缩短胚芽鞘长度和苗期活力，深播时会影响出苗(EllisMH,RebetzkeGJ,ChandlerP,BonnettD,SpielmeyerW,RichardsRA.2004.Theeffectofdifferentheightreducinggenesontheearlygrowthofwheat.FunctionalPlantBiology,31:583-589)。发掘、应用新的矮秆基因和矮秆种质，对矮化、抗倒伏育种具有重要的意义。目前，已经报道的小麦矮秆基因有25个，除了Rht1、Rht2、Rht8在生产应用之外，其它矮秆基因尚未成功应用。研究发现，矮秆基因Rht12在降低株高的同时，不影响胚芽鞘长度和苗期活力，且可显著提高穗粒数和收获系数，具有较高的应用价值。然而，矮秆基因Rht12尚未有准确、高效的分子标记，不利于分子标记辅助选择育种。KASP(KompetitiveAlleleSpecificPCR；竞争性等位基因特异性PCR)，可对广泛存在于基因组DNA中的SNPs或InDels进行精准的判断，是一种高通量、经济、有效的SNP分型技术。开发矮秆基因Rht12的KASP标记，有助于实现Rht12的分子标记辅助育种。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题：小麦生产上应用的矮秆基因单一，目前主要依赖Rht1、Rht2等少数矮秆基因，遗传基础狭窄，遗传多样性低。为了促进小麦矮化、抗倒伏育种的可持续发展，本专利技术提供的解决上述技术问题的思路是在生产上需要引入新的矮秆基因，比如Rht12等。具体而言，本专利技术给出小麦矮秆基因Rht12紧密连锁的KASP标记，所述矮秆基因Rht12位于小麦5AL染色体末端，与其紧密连锁的KASP标记为5A-6774933，小麦矮秆基因Rht12与5A-6774933的遗传距离为0.4cM。所述KASP标记5A-6774933对应的引物，包括两条正向特异引物F-矮和F-高以及一条共用反向引物R。所述正向特异引物F-矮的核苷酸序列为5’GGACACACATGCTTTGACATAATTTGT3’。所述正向特异引物F-高的核苷酸序列为5’GACACACATGCTTTGACATAATTTGC3’。所述共用反向引物R的核苷酸序列为5’CAATTATCGCTTCAGGTCTTCTTGAAGA3’。进一步地，在合成KASP标记5A-6774933对应的引物时，所述正向特异引物F-矮的5’端加上HEX荧光接头序列，HEX荧光接头序列为5’GAAGGTCGGAGTCAACGGATT3’；所述正向特异引物F-高的5’端加上FAM荧光接头序列，FAM接头序列为：5’GAAGGTGACCAAGTTCATGCT3’。基于所述的小麦矮秆基因Rht12紧密连锁的KASP标记，本专利技术还给出了一种筛选具有矮秆基因Rht12的小麦材料的方法，筛选步骤如下：(1)检测：采用所述KASP标记5A-6774933的引物，对待测小麦材料的基因组DNA进行PCR扩增和基因分型。(2)结果判断：根据基因分型结果判断待测小麦材料是否含有矮秆基因Rht12，以及矮秆基因Rht12的基因型。由于PCR试剂中含有荧光物质，所以PCR产物也会带不同的荧光。酶标仪读取荧光数据后，再用基因分型软件KlusterCaller把颜色归类。根据颜色归类，基因分型结果中显示为红色或绿色的材料为具有矮秆基因Rht12的小麦材料，其中，结果显示红色的材料为纯合矮秆材料，结果显示绿色的材料为杂合矮秆材料。结果显示蓝色的材料为不含矮秆基因Rht12的高秆材料。结果显示黑色的材料为阴性对照，结果显示紫色的材料为分型失败的材料。作为所述筛选方法的优选，所述PCR扩增反应体系为5μL，包括2.5μL的2×KASPMastermix，0.056μL的混合引物，100ng的基因组DNA，超纯水补足至5μL。作为所述筛选方法的优选，所述混合引物包括两条正向特异引物F-矮和F-高以及一条共用反向引物R，正向特异引物F-矮和F-高的浓度各为12mM(毫摩尔/升)，共用反向引物R的浓度为30mM(毫摩尔/升)。作为所述筛选方法的优选，所述PCR扩增的程序为：94℃预变性15min，94℃变性20s；61℃退火60s，每循环一次降0.6℃，10个循环；94℃变性20s，55℃退火60s，32个循环。作为所述筛选方法的优选，所述检测指PCR扩增反应后用酶标仪读取终端荧光读数，然后将数据导入软件进行基因分型。进一步优选地，所用酶标仪的型号为FLUOstarOmega，基因分型的数据处理软件为KlusterCaller软件。若基因分型的检测结果不明显，可通过至少3个补加循环后再进行基因分型，所述补加循环的程序为：94℃变性20s，57℃退火60s。酶标仪读取荧光数据后，再用基因分型软件KlusterCaller把颜色归类。根据颜色归类，基因分型结果中显示为红色或绿色的材料为具有矮秆基因Rht12的小麦材料，其中红色为纯合矮秆材料，绿色为杂合矮秆材料；基因分型结果中显示为蓝色的材料为不含矮秆基因Rht12的高秆材料，黑色为阴性对照，紫色为分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.小麦矮秆基因Rht12紧密连锁的KASP标记，所述矮秆基因Rht12位于小麦5AL染色体末端，与其紧密连锁的KASP标记为5A‑6774933，Rht12与5A‑6774933的遗传距离为0.4cM。

【技术特征摘要】
1.小麦矮秆基因Rht12紧密连锁的KASP标记，所述矮秆基因Rht12位于小麦5AL染色体末端，与其紧密连锁的KASP标记为5A-6774933，Rht12与5A-6774933的遗传距离为0.4cM。2.根据权利要求1所述的小麦矮秆基因Rht12紧密连锁的KASP标记，其特征在于，所述KASP标记5A-6774933对应的引物，包括两条正向特异引物F-矮和F-高以及一条共用反向引物R；所述正向特异引物F-矮的核苷酸序列为5’GGACACACATGCTTTGACATAATTTGT3’；所述正向特异引物F-高的核苷酸序列为5’GACACACATGCTTTGACATAATTTGC3’；所述共用反向引物R的核苷酸序列为5’CAATTATCGCTTCAGGTCTTCTTGAAGA3’。3.根据权利要求2所述的小麦矮秆基因Rht12紧密连锁的KASP标记，其特征在于，在合成KASP标记5A-6774933对应的引物时，所述正向特异引物F-矮的5’端加上HEX荧光接头序列，HEX荧光接头序列为5’GAAGGTCGGAGTCAACGGATT3’；所述正向特异引物F-高的5’端加上FAM荧光接头序列，FAM接头序列为：5’GAAGGTGACCAAGTTCATGCT3’。4.一种筛选具有矮秆基因Rht12的小麦材料的方法，其利用权利要求1至3中任一项所述的小麦矮秆基因Rht12紧密连锁的KASP标记，筛选步...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈亮，胡银岗，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61