一种低分子量肝素的制备方法技术

一种低分子量肝素的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤：a）Phe‑Leu‑Asn‑Gln‑Asp和sepharose交联；b）交联后凝胶加入8倍体积46mM磷酸钠缓冲液，溶胀后吸去上清；c）肝素溶在1倍体积缓冲液中，0.5mg凝胶配比3mg肝素的比例上样，上样后玻璃棒搅拌3min后，静置15min，吸去上清；d）肝素的活性中心位点吸附在凝胶的五肽上后，加入肝素酶，在水浴中35℃搅拌水解；e）肝素游离的部分就被随机部分水解，水解后离心，取沉淀；f）沉淀中加入一倍体积的1M的NaCl溶液后离心，取上清；g）上清浓缩后过用纯净水bio gel P2柱子，自动部分收集，220nm紫外检测，去掉盐分，收集有紫外吸收部分合并，冻干即得。

Preparation of a low molecular weight heparin

A preparation method of low molecular weight heparin, the preparation method includes the following steps: a) Phe Leu Asn Gln Asp and Sepharose crosslinking; b) after crosslinking, the gel is added to 8 times the volume of sodium phosphate buffer and then sucked to the supernatant after swelling; c) heparin is dissolved in 1 times the volume buffer, 0.5mg gel is proportionally proportional to the heparin heparin. After mixing the sample, the glass rod is stirred for 3min, then 15min and sucked to the supernatant; d) the active center site of heparin is adsorbed on the five peptide of the gel, adding heparinase, stirring and hydrolyzing at 35 C in the water bath; E) the free part of the heparin is hydrolyzed partly, centrifuged, precipitated, f) and adding a double volume in the precipitate. 1M NaCl solution centrifugation, Torikami Kiyo; g) supernatant after concentration of purified water bio gel P2 column, automatic part collection, 220nm UV detection, remove salt, collection of ultraviolet absorption part merger, freeze dry that is obtained.

【技术实现步骤摘要】
一种低分子量肝素的制备方法
本专利技术涉及的是一种低分子量肝素的制备方法，属于生化

技术介绍
肝素抗凝活性取决于它与丝氨酸蛋白酶抑制剂、抗凝血酶III(AT)的相互作用。在与肝素结合的过程中，AT发生了一种构象变化，增强了其不可逆转的抑制凝血酶的能力，包括凝血酶和因子Xa。肝素-AT相互识别是研究较为透彻的多糖和蛋白相互作用的实例。肝素和AT的识别和依赖于肝素中特定的肝素五糖结构区域。而这特定的肝素五糖在结构上的主要特征是在五糖中间的氨基葡萄糖残基存在3-O硫酸基修饰。低分子量肝素三位硫酸化修饰的片段减少，分子量降低，所以活性降低，但是安全性增加。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种能提高生物活性和安全性的低分子量肝素的制备方法。本专利技术的目的是通过如下技术方案来完成的，一种低分子量肝素的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤：a）Phe-Leu-Asn-Gln-Asp和sepharose交联；b）交联后凝胶加入8—12倍体积46—54mM磷酸钠缓冲液，pH7.2—7.5，溶胀后吸去上清；c）肝素溶在1—1.5倍体积缓冲液中，0.5—1.5mg凝胶配比3mg肝素的比例上样，上样后玻璃棒搅拌3—10min后，静置15—35min，吸去上清；d）肝素的活性中心位点吸附在凝胶的五肽上后，按1—5mg肝素加入2mU肝素酶II的比例，在水浴中35—40℃搅拌水解2—5h；e）肝素游离的部分就被随机部分水解，水解后4000rpm离心，取沉淀；f）沉淀中加入一倍体积的1M的NaCl溶液后离心，取上清；g）上清浓缩后过用纯净水biogelP2柱子，自动部分收集，220nm紫外检测，去掉盐分，收集有紫外吸收部分合并，冻干即得。作为优选：所述的步骤b）中，交联后凝胶加入10倍体积50mM磷酸钠缓冲液，pH7.4，溶胀后吸去上清；所述的在步骤c）中，肝素溶在1倍体积缓冲液中，1mg凝胶配比3mg肝素的比例上样，上样后玻璃棒搅拌5min后，静置20min，吸去上清；所述的步骤d）中，肝素的活性中心位点吸附在凝胶的五肽上后，按3mg肝素加入2mU肝素酶II的比例，在水浴中37℃搅拌水解4h。本专利技术采用肝素酶对肝素进行选择性酶切，得到具有新颖结构的低分子量肝素。与现有技术相比，本专利技术具有如下技术效果：和普通低分子量肝素不同的是每个低分子量肝素的片段中均含有一个活性中心；完全酶解后，和普通低分子量肝素相比，三位硫酸化四糖的含量提高1.5倍，产物抗凝血活性提高了一倍。具体实施方式下面将结合具体实施例对本专利技术作详细的介绍：本专利技术所述的一种低分子量肝素的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤：a）Phe-Leu-Asn-Gln-Asp和sepharose交联；b）交联后凝胶加入8—12倍体积46—54mM磷酸钠缓冲液，pH7.2—7.5，溶胀后吸去上清；c）肝素溶在1—1.5倍体积缓冲液中，0.5—1.5mg凝胶配比3mg肝素的比例上样，上样后玻璃棒搅拌3—10min后，静置15—35min，吸去上清；d）肝素的活性中心位点吸附在凝胶的五肽上后，按1—5mg肝素加入2mU肝素酶II的比例，在水浴中35—40℃搅拌水解2—5h；e）肝素游离的部分就被随机部分水解，水解后4000rpm离心，取沉淀；f）沉淀中加入一倍体积的1M的NaCl溶液后离心，取上清；g）上清浓缩后过用纯净水biogelP2柱子，自动部分收集，220nm紫外检测，去掉盐分，收集有紫外吸收部分合并，冻干即得。作为一种最佳实施例：本专利技术所述的一种低分子量肝素的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤：a）Phe-Leu-Asn-Gln-Asp和sepharose交联；b）联后凝胶加入10倍体积50mM磷酸钠缓冲液，pH7.4，溶胀后吸去上清；c）肝素溶在1倍体积缓冲液中，1mg凝胶配比3mg肝素的比例上样，上样后玻璃棒搅拌5min后，静置20min，吸去上清；d）肝素的活性中心位点吸附在凝胶的五肽上后，按3mg肝素加入2mU肝素酶II的比例，在水浴中37℃搅拌水解4h。e）肝素游离的部分就被随机部分水解，水解后4000rpm离心，取沉淀；f）沉淀中加入一倍体积的1M的NaCl溶液后离心，取上清；g）上清浓缩后过用纯净水biogelP2柱子，自动部分收集，220nm紫外检测，去掉盐分，收集有紫外吸收部分合并，冻干即得。本专利技术的其它实施例可以在上述实施例的基础上，通过数值替换和惯用手段的替换等可以获得无数个具体实施例，且本领域技术人员在了解本专利技术的基础上，能够方便地实施本专利技术。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种低分子量肝素的制备方法，其特征在于所述的制备方法包括如下步骤：a）Phe‑Leu‑Asn‑Gln‑Asp和sepharose交联；b）交联后凝胶加入8—12倍体积46—54mM磷酸钠缓冲液，pH7.2—7.5，溶胀后吸去上清；c）肝素溶在1—1.5倍体积缓冲液中，0.5—1.5mg凝胶配比3mg肝素的比例上样，上样后玻璃棒搅拌3—10min后，静置15—35min，吸去上清；d）肝素的活性中心位点吸附在凝胶的五肽上后，按1—5mg肝素加入2 mU肝素酶II的比例，在水浴中35—40 ℃搅拌水解2—5h；e）肝素游离的部分就被随机部分水解，水解后4000rpm离心，取沉淀；f）沉淀中加入一倍体积的1M的NaCl溶液后离心，取上清；g）上清浓缩后过用纯净水bio gel P2柱子，自动部分收集，220nm紫外检测，去掉盐分，收集有紫外吸收部分合并，冻干即得。

【技术特征摘要】
1.一种低分子量肝素的制备方法，其特征在于所述的制备方法包括如下步骤：a）Phe-Leu-Asn-Gln-Asp和sepharose交联；b）交联后凝胶加入8—12倍体积46—54mM磷酸钠缓冲液，pH7.2—7.5，溶胀后吸去上清；c）肝素溶在1—1.5倍体积缓冲液中，0.5—1.5mg凝胶配比3mg肝素的比例上样，上样后玻璃棒搅拌3—10min后，静置15—35min，吸去上清；d）肝素的活性中心位点吸附在凝胶的五肽上后，按1—5mg肝素加入2mU肝素酶II的比例，在水浴中35—40℃搅拌水解2—5h；e）肝素游离的部分就被随机部分水解，水解后4000rpm离心，取沉淀；f）沉...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈荫，赵玉勤，孙坤来，王斌，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33