一种相对定量分析肉鸡谷胱甘肽S转移酶GSTA2的方法技术

本发明专利技术公开了一种相对定量分析肉鸡谷胱甘肽S转移酶GSTA2的方法，先进行肉鸡谷胱甘肽S转移酶GSTA2的提取，再对肉鸡谷胱甘肽S转移酶GSTA2进行酶切获得特异性肽段，然后使用液质联用仪检测特异性肽段的子母离子对，获得特异性肽段的子离子信号强度总和，根据特异肽段的子离子信号强度总和获得GSTA2蛋白的信号强度，通过比较不同处理肉鸡样品中GSTA2蛋白的信号强度，从而实现对不同处理肉鸡样品中GSTA2蛋白的相对定量；肉鸡谷胱甘肽S转移酶GSTA2的特异性肽段为3条，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。本发明专利技术的方法相对于基于抗体Western Blot法特异性更强，并且免去了制备抗体的繁琐步骤，提高了鸡源GSTA2蛋白检测通量和效率。 1

A relative quantitative analysis of glutathione S transferase GSTA2 in Broilers

The invention discloses a method of relative quantitative analysis of glutathione S transferase GSTA2 in broiler, first to extract the glutathione S transferase GSTA2 of broiler, and then to obtain the specific peptide segment by cutting the glutathione S transferase GSTA2 of broiler, and then using the liquid chromatograph to detect the specific peptide segment of the mother ion pair. The sum of the signal intensity of the sub ion signal of the peptide was obtained, and the signal intensity of the GSTA2 protein was obtained according to the sum of the sub ion signal intensity of the specific peptide segment. By comparing the signal intensity of the GSTA2 protein in the broiler samples, the relative quantity of GSTA2 protein in different broiler samples was achieved, and the glutathione S transferase GSTA2 of broiler was GSTA2. The specific peptides were 3, and their amino acid sequences were SEQ, ID, NO:1, SEQ, ID, NO:2 and SEQ ID ID NO:3 respectively. The method of the present invention is more specific than the antibody Western Blot method, and avoids the tedious steps of preparing the antibody, and improves the flux and efficiency of the detection of GSTA2 protein in chicken source. One

【技术实现步骤摘要】
一种相对定量分析肉鸡谷胱甘肽S转移酶GSTA2的方法
本专利技术涉及生化分析
，特别是指一种相对定量分析肉鸡谷胱甘肽S转移酶GSTA2的方法。
技术介绍
热应激是肉鸡生产中广受关注的问题，是动物生长过程中常见的一种体外应激，当动物的生长环境温度超过其代谢稳定区上限，通过机体物理调节不能维持热平衡时，导致机体会产生应对环境高温所产生的非特异性应答反应。大量研究表明热应激条件下肉鸡采食量会下降14％～17％，同时还会造成肉鸡免疫力下降、消化疾病多发、消化率下降，严重影响肉鸡成活率和饲料利用率，给养鸡业带来经济损失。据报道，美国每年因热应激造成畜牧生产损失约16.9～23.6亿美元，其中家禽生产损失达1.25～1.65亿美元，肉鸡损失约5200万美元。相比美国，我国也是肉鸡养殖大国，生产与消费均位居世界第二，但行业集团化、产业化程度不足，养殖环境控制能力弱，热应激对我国肉鸡生产造成的损失更为严重。热应激主要通过氧化应激、炎症反应等途径造成细胞损伤和细胞凋亡，对动物机体组织造成损伤。当细胞处于氧化应激状态时，细胞内一系列抗氧化酶的活性提高，以维持细胞氧化-抗氧化平衡环境，提高细胞存活率。谷胱甘肽S-转移酶(GlutathioneS-transferase，GST)是具有解毒抗氧化作用的重要同工酶，构成了主要的具有重要生理功能的二聚体胞质同工酶家族，在抗毒抗氧化机制的第II阶段起作用，故也成为II时相代谢酶。II时相异生素代谢酶alpha型谷胱甘肽S-转移酶GSTA2可在细胞发生氧化应激时阻断脂质过氧化链式反应，减少炎症因子相关基因的表达，降低氧化应激损伤，提高细胞存活率。现在判断GSTA2在体内相对含量的分析方法主要是在mRNA水平、蛋白质水平进行比较，通过提取组织体内RNA后反转成cDNA，根据GSTA2基因设计特异性引物对cDNA模板进行扩增，使用荧光实时定量PCR技术对模板中GSTA2转录水平进行比较分析。由于基因转录后，还需经历剪切和拼接等转录后调控才能表达成蛋白，因此基因在转录水平上表达量并不能真实反应其基因产物蛋白的表达量。目前，在蛋白水平上分析GSTA2最能反应出该蛋白在组织、细胞和体液中的表达含量，通常会采用酶联免疫法、WesternBlot、组织原位杂交等方法，然而以上蛋白水平检测方法都需要高质量的抗体特异识别GSTA2蛋白。由于现在市场上的制备抗体的抗原蛋白多数连源于人、小鼠和大鼠等模式生物，针对鸡源GSTA2的抗体在市场上还未有出现，导致现在还没有能在蛋白水平上定量分析肉鸡GSTA2表达量的方法。若想建立在蛋白水平定量分析肉鸡GSTA2的方法，需要制备可特异识别肉鸡GSTA2的抗体。制备GSTA2单克隆抗体可以提高抗体的特异性，减少非特异结合和交叉反应，但是单克隆控体周期长、费用高；若制备GSTA2多克隆抗体可以减少费用，但是非特异性的交叉反应较为严重，成功率很低。根据定量GSTA2蛋白的表达需求，综合考虑现有的分析方法，本专利技术使用多重离子检测的方法建立一种基于质谱技术的GSTA2蛋白定量方法，该方法不需要制备抗体，根据GSTA2特异性肽段序列设计子母离子对和碰撞能量，实现在蛋白质水平上对GSTA2蛋白进行相对定量分析，大大提高了检测灵敏度、准确性和检测通量。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提出一种相对定量分析肉鸡谷胱甘肽S转移酶GSTA2的方法。本专利技术主要是为了实现相对定量分析肉鸡体内GSTA2在不同组织内表达含量变化，使用质谱技术建立了一种无需抗体的高通量检测方法。本专利技术主要利用质谱可以分析不同肽段质量，并能在可控条件性对复杂样本中的特定肽段进行碎裂，并再次分析特定多肽产生的碎裂小肽的质量，根据以上原理通过优化碰撞能量寻找到特异子母离子对，使用特异子母离子对实现对GSTA2的相对定量分析。基于上述目的，本专利技术提供的一种相对定量分析肉鸡谷胱甘肽S转移酶GSTA2的方法，先进行肉鸡谷胱甘肽S转移酶GSTA2的提取，再对肉鸡谷胱甘肽S转移酶GSTA2进行酶切获得特异性肽段，然后使用液质联用仪检测特异性肽段的子母离子对，获得特异性肽段的子离子信号强度总和，根据特异肽段的子离子信号强度总和获得肉鸡谷胱甘肽S转移酶GSTA2的信号强度，通过比较不同处理肉鸡样品中肉鸡谷胱甘肽S转移酶GSTA2的信号强度，从而实现对不同处理肉鸡样品中肉鸡谷胱甘肽S转移酶GSTA2的相对定量。在本专利技术的一些实施例中，所述肉鸡谷胱甘肽S转移酶GSTA2的特异性肽段为3条，3条特异性肽段的氨基酸序列分别为SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示；其中，SEQIDNO:1：Ala-Ile-Leu-Cys-[Cys-Ala-Met]-Tyr-Leu-Ala-Gly-Lys；SEQIDNO:2：Asn-Ile-Ala-Leu-Ile-Thr-Glu-Arg；SEQIDNO:3：Ser-Asp-Ile-Leu-Ser-Ala-Phe-Pro-Leu-Leu-Gln-Ala-Phe-Lys。在本专利技术的一些实施例中，SEQIDNO:1所示的特异性肽段的母离子为504.8m/z，子离子为551.3m/z，711.3m/z，824.4m/z，子离子所对应的碰撞电压为30～35V；SEQIDNO:2所示的特异性肽段的母离子为465.3m/z，子离子为631.4m/z，702.4m/z，815.5m/z，子离子所对应的碰撞电压为35～40V；SEQIDNO:3所示的特异性肽段的母离子为775.4m/z，子离子为816.5m/z，963.6m/z，1034.6m/z，子离子所对应的碰撞电压为30～35V。在本专利技术的一些实施例中，SEQIDNO:1所示的特异性肽段的信号强度为子离子551.3m/z，711.3m/z，824.4m/z的信号强度总和，SEQIDNO:2所示的特异性肽段的信号强度为子离子631.4m/z，702.4m/z，815.5m/z的信号强度总和，SEQIDNO:3所示的特异性肽段的信号强度为子离子816.5m/z，963.6m/z，1034.6m/z的信号强度总和，肉鸡谷胱甘肽S转移酶GSTA2的信号强度为SEQIDNO:1所示的特异性肽段、SEQIDNO:2所示的特异性肽段和SEQIDNO:3所示的特异性肽段这三条特异性肽段的信号强度总和。在本专利技术的一些实施例中，先采用液质联用仪中的高效液相色谱对3条特异性肽段进行分离，然后进入质谱进行检测；其中，分离3条特异性肽段的条件为：色谱柱为C18填料的毛细管色谱柱，流速设置在200～500nL/min，流动相A为：水+0.1wt％甲酸+5wt％DMSO，流动相B为：乙腈+0.1wt％甲酸+5wt％DMSO，在分离3条特异性肽段时采用梯度洗脱，流动相起始梯度为95％流动相A+5％的流动相B，流行相梯度为：0～1min，95％A；1～1.1min，90％A；1.1～60min，80％A；60～70min，76％A；70～75min，50％A；75～75.5min，20％A；75.5～80.5min，20％A；80.5～81min，95％A；81～90min，95％A。在本专利技术的一些实施例中，肉鸡肉鸡谷胱甘肽S转移酶GSTA2的提取步骤为：使本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种相对定量分析肉鸡谷胱甘肽S转移酶GSTA2的方法，其特征在于，先进行肉鸡谷

【技术特征摘要】
1.一种相对定量分析肉鸡谷胱甘肽S转移酶GSTA2的方法，其特征在于，先进行肉鸡谷胱甘肽S转移酶GSTA2的提取，再对肉鸡谷胱甘肽S转移酶GSTA2进行酶切获得特异性肽段，然后使用液质联用仪检测特异性肽段的子母离子对，获得特异性肽段的子离子信号强度总和，根据特异肽段的子离子信号强度总和获得肉鸡谷胱甘肽S转移酶GSTA2的信号强度，通过比较不同处理肉鸡样品中肉鸡谷胱甘肽S转移酶GSTA2的信号强度，从而实现对不同处理肉鸡样品中肉鸡谷胱甘肽S转移酶GSTA2的相对定量。2.根据权利要求1所述的相对定量分析肉鸡谷胱甘肽S转移酶GSTA2的方法，其特征在于，所述肉鸡谷胱甘肽S转移酶GSTA2的特异性肽段为3条，3条特异性肽段的氨基酸序列分别为SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示；其中，SEQIDNO:1：Ala-Ile-Leu-Cys-[Cys-Ala-Met]-Tyr-Leu-Ala-Gly-Lys；SEQIDNO:2：Asn-Ile-Ala-Leu-Ile-Thr-Glu-Arg；SEQIDNO:3：Ser-Asp-Ile-Leu-Ser-Ala-Phe-Pro-Leu-Leu-Gln-Ala-Phe-Lys。3.根据权利要求2所述的相对定量分析肉鸡谷胱甘肽S转移酶GSTA2的方法，其特征在于，SEQIDNO:1所示的特异性肽段的母离子为504.8m/z，子离子为551.3m/z，711.3m/z，824.4m/z，子离子所对应的碰撞电压为30～35V；SEQIDNO:2所示的特异性肽段的母离子为465.3m/z，子离子为631.4m/z，702.4m/z，815.5m/z，子离子所对应的碰撞电压为35～40V；SEQIDNO:3所示的特异性肽段的母离子为775.4m/z，子离子为816.5m/z，963.6m/z，1034.6m/z，子离子所对应的碰撞电压为30～35V。4.根据权利要求3所述的用于相对定量分析肉鸡谷胱甘肽S转移酶GSTA2的方法，其特征在于，SEQIDNO:1所示的特异性肽段的信号强度为子离子551.3m/z，711.3m/z，824.4m/z的信号强度总和，SEQIDNO:2所示的特异性肽段的信号强度为子离子631.4m/z，702.4m/z，815.5m/z的信号强度总和，SEQIDNO:3所示的特异性肽段的信号强度为子离子816.5m/z，963.6m/z，1034.6m/z的信号强度总和，肉鸡谷胱甘肽S转移酶GSTA2的信号强度为SEQIDNO:1所示的特异性肽段、SEQIDNO:2所示...

【专利技术属性】
技术研发人员：高杰，孟庆石，姬生跃，夏冰，张宏福，唐湘方，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11