一种基于钙调蛋白性质的蛋白纯化方法技术

本发明专利技术涉及一种基于钙调蛋白性质的蛋白纯化方法。具体技术方案如下：将多肽链CBD固定在色谱柱填料上成为CBD色谱柱，多肽链CBD是能与钙调蛋白特异性结合的多肽；将目的蛋白以LIC克隆方法克隆到带有钙调蛋白标签的HCT表达载体中，转化表达蛋白，采用超生破碎法破菌取上清，获得可溶蛋白溶液；将所得蛋白溶液用CBD色谱柱纯化；然后用疏水色谱柱进一步纯化，继而用TEV酶进行酶切；最后用Talon柱除去标签和TEV酶。该方法利用同一标签进行多步亲和层析，非常快速高效。 1

A protein purification method based on calmodulin properties

The invention relates to a protein purification method based on calmodulin properties. The specific technical scheme is as follows: the polypeptide chain CBD is fixed on the chromatographic column filler to become a CBD column, and the polypeptide chain CBD is a polypeptide that can specifically bind to the calmodulin; the target protein is cloned by LIC cloning to the HCT expression vector with the calmodulin label, and the egg white is transformed and expressed by the supernatant breakage method to extract the supernatant. The soluble protein solution was obtained, and the obtained protein solution was purified by CBD column, then purified by the hydrophobic column, then the enzyme was cut with the TEV enzyme, and the label and TEV enzyme were removed by the Talon column. The method uses the same label for multi-step affinity chromatography, which is very fast and efficient. One

【技术实现步骤摘要】
一种基于钙调蛋白性质的蛋白纯化方法
：本专利技术涉及重组蛋白，具体为一种基于钙调蛋白性质的蛋白纯化方法。
技术介绍
：钙调蛋白是真核生物细胞中的胞质溶胶蛋白，由148个氨基酸组成单条多肽，相对分子质量为16.7kDa。钙调蛋白的外形似哑铃，有两个球形的末端，中间被一个长而富有弹性的螺旋结构相连，每个末端有两个与Ca2+结合的结构域，每个结构域可以结合一个Ca2+，一个钙调蛋白可以结合4个Ca2+。钙调蛋白与Ca2+结合后在构型上会产生明显的变化，在每一个球形末端均会暴露出疏水表面。该疏水表面的暴露使其可以与其他蛋白疏水锚定残基或疏水色谱柱填料特异性结合，故钙调蛋白可作为蛋白纯化的标签。本专利技术串联使用钙调蛋白能与特定疏水锚定残基和疏水色谱柱相结合的性质。利用两种特异性结合的纯化方式进行纯化，从而的到高纯度的蛋白。AndrewJ.McCluskey于2007年发表得文章曾将His标签与钙调蛋白标签融合，使用镍柱等金属离子亲和柱及疏水色谱中联合使用纯化蛋白，His标签与金属离子亲和柱的结合特异性不高，本专利技术设计新型CBD(能与钙调蛋白特异性结合的多肽)柱，充分利用CBD与钙调蛋白特异性结合的性质，依次使用CBD柱与疏水色谱柱，从而快速获得高纯度重组表达蛋白。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提出一种快速高效，而且为定向克隆的基于钙调蛋白性质的蛋白纯化方法。具体技术方案如下：一种基于钙调蛋白性质的蛋白纯化方法，过程如下：步骤一：将多肽链CBD固定在色谱柱填料上成为CBD色谱柱；多肽链CBD是能与钙调蛋白特异性结合的多肽；步骤二：将目的蛋白以LIC克隆方法克隆到HCT表达载体中，转化表达蛋白，采用超生破碎法破菌取上清，获得可溶蛋白溶液；步骤三：将所得蛋白溶液用CBD色谱柱纯化；步骤四：然后用疏水色谱柱进一步纯化，继而用TEV酶进行酶切；步骤五：最后用Talon柱除去标签和TEV酶。优选方案，该多肽链CBD为家兔鱼尼丁受体中能与钙调蛋白特异性结合的区域。所述步骤二可以包括如下过程：将HCT-GFP质粒转化到BL21(DE3)细胞中，2YT培养基(含50μg/mL卡那霉素)37℃培养到OD到达约0.6，0.4mMIPTG30℃诱导培养6小时；离心收集250ml表达蛋白的细菌培养物，8000g离心10min；加入40mlLysisbuffer重悬，冰浴下超声破碎；40，000g离心30分钟，弃沉淀，取上清；所述Lysisbuffer包括：10mMHEPESpH7.4，250mMKCl，25mg/mlDNA酶，25mg/ml溶菌酶，1mMPMSF，5mMCaCl2。所述步骤三可以包括如下过程：预先将多肽链CBD固定在色谱柱上，用5倍柱体积CBD柱BufferA进行平衡；以1-2ml/min的流速上样于预先平衡好的CBD色谱柱；然后用2倍柱体积CBD柱BufferC将色谱柱上的残留样品洗去；用5倍柱体积CBD柱BufferB洗脱，收集洗脱样品；所得样品用2L透析BufferA进行4h透析，除去所含EDTA，透析过后加入10mMCaCl2；所述CBD柱BufferA包括：10mMHEPESpH7.4，250mMKCl，5mMCaCl2；所述CBD柱BufferB包括：10mMHEPESpH7.4，250mMKCl，5mMEDTA；所述CBD柱BufferC包括：10mMHEPESpH7.4，250mMKCl。所述步骤四可以包括如下过程：用5倍柱体积疏水柱BufferA平衡疏水色谱柱；以1-2ml/min的流速上样于预先平衡好的色谱柱；用2倍柱体积疏水柱BufferC将色谱柱上的残留样品洗去；用5倍柱体积疏水柱BufferB洗脱，收集洗脱样品；所得样品用2L透析BufferB进行透析(除去所含EDTA)并用TEV酶进行酶切；所述疏水柱BufferA包括：10mMHEPESpH7.4，150mMKCl，10mMCaCl2；所述疏水柱BufferB包括：10mMHEPESpH7.4，75mMKCl，10mMEDTA；所述疏水柱BufferC包括：10mMHEPESpH7.4，150mMKCl。所述步骤五可以包括如下过程：用5倍柱体积Talon柱BufferA平衡色谱柱；以1-2ml/min的流速上样于预先平衡好的色谱柱；用5倍柱体积Talon柱BufferB洗脱，收集未与色谱柱结合的样品；所述Talon柱BufferA包括：10mMHEPESpH7.4，250mMKCl；所述Talon柱BufferB包括：10mMHEPESpH7.4，250mMKCl，150mM咪唑。本专利技术相对于现有技术的有点在于：本专利技术利用钙调蛋白性质，寻找一段能与其特异性结合的多肽链CBD，(SRYALLMRAFTMSAAETARRTREFR)，该多肽链为家兔鱼尼丁受体中能与钙调蛋白特异性结合的区域，并将其固定在色谱柱填料上形成CBD柱。钙调蛋白在与Ca2+结合后能与该多肽链特异性结合，在EDTA条件下，钙调蛋白与该多肽链分离。且在Ca2+与钙调蛋白结合后，钙调蛋白可与疏水色谱柱特异性结合，在EDTA条件下，钙调蛋白与色谱柱填料分离。利用两步特异性结合，可以得到高纯度带有钙调蛋白标签的目的蛋白。该专利技术设计一种新型pET基因表达载体*(HCT)，该表达载体含有组氨酸标签HIS、钙调蛋白标签CaM、TEV酶切位点，且该表达载体可以采用LIC(Ligation-Independentcloning)克隆方法，该方法非常快速高效，而且为定向克隆。TEV酶可在TEV酶切位点将组氨酸标签、钙调蛋白标签与目的蛋白切开，得到纯净的目的蛋白。附图说明：图1为CBD柱色谱图；图中，横坐标代表色谱柱洗脱体积，单位为ml，左侧纵坐标代表280nm处紫外吸收，单位为mAU，右侧纵坐标代表所含BufferB百分比，单位为1。图2为疏水柱色谱图；图中，横坐标代表色谱柱洗脱体积，单位为ml，左侧纵坐标代表280nm处紫外吸收，单位为mAU，右侧纵坐标代表所含BufferB百分比，单位为1。图3为Talon柱色谱图；图中，横坐标代表色谱柱洗脱体积，单位为ml，左侧纵坐标代表280nm处紫外吸收，单位为mAU，右侧纵坐标代表所含BufferB百分比，单位为1。图4为纯化过程SDS-PAGE；泳道1：细胞裂解液；泳道2：CBD柱未挂柱组分；泳道3：CBD柱洗脱组分(目的蛋白)；泳道4：疏水色谱柱未挂柱组分；泳道5：疏水色谱柱洗脱组分(目的蛋白)；泳道6：TEV酶切后；泳道7：Talon柱未挂柱组分(目的蛋白)；泳道8：Talon柱洗脱组分。具体实施方式：实施例：将绿色荧光蛋白(GFP)将目的蛋白以LIC克隆方法克隆到HCT表达载体中。用大肠杆菌进行蛋白表达。实验中使用试剂及缓冲液的配制：Lysisbuffer:10mMHEPESpH7.4，250mMKCl，25mg/mlDNA酶，25mg/ml溶菌酶，1mMPMSF，5mMCaCl2CBD柱BufferA:10mMHEPESpH7.4，250mMKCl，5mMCaCl2；BufferB:10mMHEPESpH7.4，250mMKCl，5mMEDTA；BufferC:10mMHEPESpH7.4，250mMKCl；疏水柱BufferA：10本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于钙调蛋白性质的蛋白纯化方法，其特征在于，过程如下：

【技术特征摘要】
1.一种基于钙调蛋白性质的蛋白纯化方法，其特征在于，过程如下：步骤一：将多肽链CBD固定在色谱柱填料上成为CBD色谱柱；多肽链CBD是能与钙调蛋白特异性结合的多肽；步骤二：将目的蛋白以LIC克隆方法克隆到HCT表达载体中，转化表达蛋白，采用超生破碎法破菌取上清，获得可溶蛋白溶液；步骤三：将所得蛋白溶液用CBD色谱柱纯化；步骤四：然后用疏水色谱柱进一步纯化，继而用TEV酶进行酶切；步骤五：最后用Talon柱除去标签和TEV酶。2.根据权利要求1所述一种基于钙调蛋白性质的蛋白纯化方法，其特征在于，该多肽链CBD为家兔鱼尼丁受体中能与钙调蛋白特异性结合的区域。所述CBD柱BufferB包括：10mMHEPESpH7.4，250mMKCl，5mMEDTA；所述CBD柱BufferC包括：10mMHEPESpH7.4，250mMKCl。3.根据权利要求2所述一种基于钙调蛋白性质的蛋白纯化方法，其特征在于，所述步骤二包括如下过程：将HCT-GFP质粒转化到BL21(DE3)细胞中，2YT培养基(含50μg/mL卡那霉素)37℃培养到OD到达约0.6，0.4mMIPTG30℃诱导培养6小时；离心收集250ml表达蛋白的细菌培养物，8000g离心10min；加入40mlLysisbuffer重悬，冰浴下超声破碎；40，000g离心30分钟，弃沉淀，取上清；所述Lysisbuffer包括：10mMHEPESpH7.4,250mMKCl，25mg/mlDNA酶,25mg/ml溶菌酶,1mMPMSF，5mMCaCl2。4.根据权利要求2所述一种基于钙调蛋白性质的蛋白纯化方法，其特征在于，所述步骤三包括如下过程：预先将多肽链CBD固定在色谱柱上,用5倍柱体积CBD柱BufferA进行平衡；以1-2ml/min的流速上样于预先平衡好的CBD色谱柱；然后用2倍柱体积CBD...

【专利技术属性】
技术研发人员：尉迟之光，林联云，刘晨，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12