一种利用基因工程技术改善番茄果径、果重的新方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种利用基因工程技术改善番茄果径、果重的新方法。现有技术主要通过改变肥料用量、施用特定化肥、改善种植方法等外部技术改善番茄的果径和果重，但这类技术无法对番茄本身的性状做出根本性改变，且操作困难，对环境、技术、操作人员等要求较高。即使研发出优良种植方法，也往往存在更换种植环境就难以得到相同种植结果的问题。因此，深入到分子遗传机理，对番茄果径、果重进行研究，对其育种工作具有重要的现实意义。本发明专利技术发现SlEB1基因与番茄的果径、果重的大小密切相关，沉默该基因后，转基因生成的番茄果径和果重明显增加，可实际应用于生产和生活中。

A new method of improving tomato fruit diameter and fruit weight by genetic engineering technology

The invention belongs to the field of biotechnology, and specifically relates to a new method of improving tomato fruit diameter and fruit weight by using genetic engineering technology. The existing technology mainly improves the fruit diameter and fruit weight of Tomato by changing the amount of fertilizer, applying specific fertilizer and improving the planting method. However, this kind of technology can not make fundamental changes to the characters of tomato itself, and the operation is difficult, and the requirements of environment, technology and operators are higher. Even with the development of good planting methods, it is often difficult to get the same results when changing the planting environment. Therefore, it is of great practical significance to study the molecular genetic mechanism and study the fruit diameter and fruit weight of tomato. It is found that the SlEB1 gene is closely related to the size and weight of tomato. After silencing the gene, the diameter and fruit weight of the transgenic tomato can be significantly increased, which can be applied to production and life.

【技术实现步骤摘要】
一种利用基因工程技术改善番茄果径、果重的新方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种利用基因工程技术改善番茄果径、果重的新方法。
技术介绍
番茄是果实类蔬菜的代表。番茄果实色彩鲜艳、肉厚汁多、风味独特，且富含多种维生素、有机酸、氨基酸、矿物质和类黄酮等，不仅营养价值高，还具有抗氧化、助消化、降血脂和抑癌等诸多益处，故深受消费者喜爱。果径和果重是整个番茄选育过程中，被极为看重的性状。其重量从最初野生番茄的单果重几克发展到如今单果重量可达1kg甚至更高；其大小也从最开始的小果发展至极大果和极大果并存。不同国家和地区的消费者，对番茄的重量和大小有着不同的偏好，对于鲜食番茄而言，有人偏好大果，有人偏好樱桃番茄；对于加工番茄而言，厂商多偏向于选择处于中等大小的番茄，以便于生产。目前，种植业内改善番茄重量和大小的方法，一般为改变肥料用量、施用特定化肥、改善种植方法等外部技术，无法对番茄本身的性状做出根本性改变，且操作困难，对环境、技术、操作人员等要求较高。即使研发出优良种植方法，也往往存在更换种植环境就难以得到相同种植结果的问题。因此，深入到分子遗传机理，对番茄果径、果重进行研究，对其育种工作具有重要的现实意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用基因工程技术改善番茄果径、果重的新方法。为实现上述专利技术目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种利用基因工程技术改善番茄果径、果重的新方法，所述基因工程技术中，选择的基因为番茄的SlEB1基因。优选的，所述SlEB1基因包括SlEB1a基因和SlEB1b基因；所述SlEB1a的DNA序列如SEQIDNO1所示；所述SlEB1b的DNA序列如SEQIDNO2所示。优选的，所述的利用基因工程技术改善番茄果径、果重的新方法，其具体步骤为：(1)构建同时沉默SlEB1a基因和SlEB1b基因的RNAi载体：pBI121:SlEB1a/SlEB1bRi；(2)用所述RNAi载体pBI121:SlEB1a/SlEB1bRi转化农杆菌；(3)用农杆菌介导的遗传转化法转化番茄种子，常规种植后得到改善了果径、果重的转基因番茄。本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术提供了一种利用基因工程技术改善番茄果径、果重的新方法，对番茄的可食用性状改善具有极大应用价值；2、本专利技术发现了SlEB1基因在番茄生长发育过程中的新作用，其与番茄的大小密切相关，沉默后可显著提高番茄成熟后的果径和果重；3、本专利技术为改善番茄可食用性状提供了新思路，为深入研究番茄的基因组应用提供了理论基础。附图说明图1为SlEB1a和SlEB1b基因在番茄不同组织中的表达情况；图2为WT、SlEB1-OE、SlEB1-RNAi自然红熟期果实对比图；图3为WT、SlEB1-OE、SlEB1-RNAi自然红熟期果实果径大小对比图；图4为WT、SlEB1-OE、SlEB1-RNAi自然红熟期果实重量对比图。具体实施方式实施例涉及的试剂、材料、仪器和测序说明：本专利技术所用氯仿、异丙醇、乙醇等常规化学试剂购自成都市科龙化工试剂厂；RNase-free的吸头和离心管购自爱思进生物技术(杭州)有限公司；RNase-freeddH2O、DNA回收试剂盒、DNA连接试剂盒、定量PCR试剂盒、基因组DNA提取试剂盒和大肠杆菌DH5α感受态细胞购自康为世纪生物科技有限公司；反转录试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；高保真PCR酶购自北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶和TRIzolReagent购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；农杆菌EHA105感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司。DNA测序和引物合成均在成都擎科梓熙生物技术有限公司进行。所用离心机为：ThermoFisher高速冷冻离心机，型号ST16R。实施例一：番茄SlEB1基因的cDNA克隆和时空表达分析1、SlEB1基因序列分析搜索番茄基因组数据库，番茄有两个AtEB1同源基因，即SlEB1a(Solyc03g116370)和SlEB1b(Solyc02g092950)；SlEB1a的DNA序列如SEQIDNO1所示；SlEB1b的DNA序列如SEQIDNO2所示。2、番茄总RNA的提取(1)取等量番茄根、茎、叶、花和不同发育阶段的果实，分为各组，分别在液氮中充分研磨；再分别加入TRIzolReagent(每100mg样品加入1mLTRIzolReagent)，充分混匀后室温放置5min。其中，所述不同发育阶段分别为：IG1(ImmatureGreen1，绿色未熟I期)、IG2(ImmatureGreen1，绿色未熟Ⅱ期)、IG3(ImmatureGreen1，绿色未熟Ⅲ期)、MG(MatureGreen，绿熟期)、Br(Breaker，破色期)和RR(RedRipening，自然红熟期)。(2)每1mLTRIzolReagent加200μL氯仿，剧烈震荡15s，室温放置3min；4℃12000rpm离心15min，将上清转移到新的EP管。(3)分别在各组的上清液中加入等体积的氯仿并充分混匀，4℃12000rpm离心15min，将上清转移到新的EP管；(4)分别在步骤(3)得到的上清液中加入等体积的异丙醇，混匀，室温放置10min；而后4℃12000rpm离心10min，去上清；(5)分别对沉淀加1mL75％的乙醇，4℃7500g离心5min，去上清，而后重复一次本步骤；(6)再加1mL75％的乙醇，4℃7500g离心5min，去上清；(7)室温下，倒扣EP管晾干5min；加入30μLRNase-freeddH2O，55-60℃10min溶解沉淀；电泳检测总RNA的浓度和纯度。3、番茄cDNA的合成番茄的cDNA合成分以下两步进行：(1)去除基因组DNA。反应体系为5xgDNAEraserBuffer2.0μL，gDNAEraser1.0μL，总RNA2μg，RNase-freeddH2O补齐至10μL；反应条件为42℃，2min。(2)反转录cDNA。反应体系为PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL，RTPrimerMix1μL，5xPrimeScriptBuffer4μL，RNase-freeddH2O4μL；反应条件为37℃15min，85℃5sec。(3)合成的cDNA于-80℃条件下保存。4、SlEB1a和SlEB1b基因编码区的PCR扩增以步骤3合成的cDNA为模板，PCR扩增SlEB1a和SlEB1b基因的编码区。反应体系为cDNA1μL，10μMForwardPrimer1μL，10μMReversePrimer1μL，2.5mMdNTP5μL，5xFastPfuBffer10μL，TransStartFastPfuDNAPolymerase1μL，ddH2O31μL；反应条件为95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃1min(30个循环)；72℃5min。SlEB1a和SlEB1b基因的PCR扩增引物如下：SlEB1a-F:5’ATGGCGAATATAGGGATAATGG3’；SlEB1a-R:5’TCAGCTTTTACTTCCATCCACG3’；SlEB1b-F:5’ATGGCGGCACACATAGGAATGATGG3’；SlEB1b-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用基因工程技术改善番茄果径、果重的新方法，其特征在于：所述基因工程技术中，选择的基因为番茄的SlEB1基因。

【技术特征摘要】
1.一种利用基因工程技术改善番茄果径、果重的新方法，其特征在于：所述基因工程技术中，选择的基因为番茄的SlEB1基因。2.根据权利要求1所述的利用基因工程技术改善番茄果径、果重的新方法，其特征在于：所述SlEB1基因包括SlEB1a基因和SlEB1b基因；所述SlEB1a的DNA序列如SEQIDNO1所示；所述SlEB1b的DNA序列如SEQIDNO2所示。3....

【专利技术属性】
技术研发人员：汪松虎，许春燕，蒲勤华，黄维藻，李辉，高兰阳，
申请(专利权)人：中国科学院成都生物研究所，成都碧青生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51