由干细胞制备心外膜细胞的方法技术

本发明专利技术提供由多能干细胞制备心外膜细胞的方法，所述方法包括：1)通过激活WNT信号通路将所述多能干细胞诱导分化成中胚层细胞；2)通过抑制WNT信号通路使步骤1)中获得的中胚层细胞转化成心肌前体细胞；3)通过激活成纤维细胞生长因子信号通路和WNT信号通路使步骤2)中获得的心肌前体细胞转化成前心外、膜细胞；以及的由步骤3)中获得的前心外、膜细胞制备心外、膜细胞。本发明专利技术还涉及由多能干细胞制备血管平滑肌细胞和心脏成纤维细胞的方法以及通过上述方法制备的心外膜细胞、血管平滑肌细胞和心脏成纤维细胞及其用途。

Methods of preparing epicardial cells from stem cells

The present invention provides a method for preparing epicardium cells from a multipotent stem cell, including: 1) inducing the pluripotent stem cells to differentiate into mesoderm cells by activating the WNT signaling pathway; 2) transforming the mesoderm cells obtained in step 1 by inhibiting the WNT signaling pathway into a cardiac precursor cell; 3) by activating a fibroblast cell. The growth factor signal pathway and the WNT signaling pathway make the cardiac precursor cells obtained in step 2 into the anterior and membrane cells; and the extracellular and membrane cells obtained from the anterior and membrane cells obtained from step 3. The invention also relates to the method of preparing vascular smooth muscle cells and cardiac fibroblasts by multipotent stem cells, and the epicardial cells, vascular smooth muscle cells and cardiac fibroblasts prepared by the above methods and their uses.

【技术实现步骤摘要】
由干细胞制备心外膜细胞的方法
本申请涉及由多能干细胞制备心外膜细胞的方法，并且还涉及由多能干细胞制备血管平滑肌细胞和心脏成纤维细胞的方法，以及通过上述方法制备的心外膜细胞、血管平滑肌细胞和心脏成纤维细胞及其用途如心外膜细胞用于心脏损伤修复与筛选治疗心脏损伤的新疗法，以及再分化为血管平滑肌细胞用于疾病和药物筛选模型，血管组织工程。
技术介绍
心外膜系细胞在胚胎心脏发育过程中是必需的。心外膜细胞的前体细胞：前心外膜细胞，源自脏壁中胚层，在心管的流入道处紧挨心房和静脉窦后部的位置发育。前心外膜细胞的精准来源位置并不十分清楚，然而遗传谱系追踪实验显示前心外膜细胞与心肌细胞共同来自一个心脏形成前体细胞库。在心脏发育的环化阶段，前心外膜细胞向心管方向迁移，并逐渐覆盖整个心脏的表面形成心外膜。此后，一部分的心外膜细胞经过上皮向间充质转化过程侵入到心肌层。这些心外膜来源的细胞进一步分化为血管平滑肌和心脏成纤维细胞。其中血管平滑肌参与构建心脏冠状血管，心脏成纤维细胞主要构建心脏结构。除此之外，心外膜细胞还能通过分泌成纤维细胞生长因子、FGF9、IGF2、FSTL1等因子来促进心肌的增殖、成熟或再生。在成年哺乳动物心脏中，绝大部分的心外膜细胞不再表达胚胎期的分子标记基因TBX18和WT1。心梗或胸腺素β4注射能够激活这两个基因在成体心外膜和心外膜下层细胞中的再表达，使其活化并分化为平滑肌和成纤维细胞以促使心梗区新血管的生成。此外，有研究显示将人心外膜来源细胞移植到小鼠心梗模型中能够提高发生心梗的小鼠心脏机能和血管再生。除此之外，在小鼠和猪的心梗模型中证明心外膜所分泌的FSTL1能促进成体心肌细胞再生。这些实验表明心外膜细胞，尤其是表达TBX18和WT1的心外膜细胞是治疗心梗的潜在移植细胞来源。最近世界上有两个利用细胞因子如：FGF2、BMP4、activinA、VEGF和WNT3A以及含动物源成分的培养基来分化WT1+心外膜细胞的方法报道。这两种方法成本高昂，操作复杂，其分化培养基中所含动物源成分不利于所分化心外膜细胞的临床使用和研究。这些缺点阻碍了心外膜细胞的大规模研究及使用。本专利技术解决了这几个缺点。
技术实现思路
在一个实施方案中，本专利技术提出了利用一种由小分子化合物高效诱导的心肌前体细胞来诱导前心外膜细胞的方法。所述方法包括在干细胞的分化起始阶段利用WNT信号激动剂如CHIR99021来诱导中胚层细胞，而后利用WNT信号通路抑制剂如IWR1来促进心肌前体细胞的形成。在该种分化方法下能得到极高比例的心肌前体细胞。在另一个实施方案中，本专利技术提供了利用小分子化合物高效诱导心肌前体细胞为前心外膜细胞的方法。所述方法包括利用成纤维细胞生长因子(硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG))和WNT信号激动剂CHIR99021来协同诱导TBX18和WT1双阳性的前心外膜细胞。还提供了由上述方法产生的前心外膜细胞。进一步提供了包含已分化形成中胚层并经刺激成纤维细胞生长因子和WNT信号通路的外源性试剂处理的干细胞的组合物。在另一个实施方案中，本专利技术提供了由多能干细胞生成心外膜细胞的方法。所述方法包括：1)将多能干细胞与试剂CHIR99021接触来诱导中胚层细胞分化；2)经所述试剂CHIR99021诱导的中胚层细胞与另一种试剂IWR1相接触以形成心肌前体细胞；3)已分化形成的心肌前体细胞经硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)和CHIR99021处理，形成TBX18和WT1双阳性的前心外膜样的细胞。4)前心外膜细胞经过低密度传代获得典型的心外膜形态。还提供了由上述方法产生的前心外膜细胞和心外膜细胞。在另一个实施方案中，本专利技术提供了了一种不需要细胞因子，利用化学成分已知、不含动物源成分的培养基来分化人心外膜细胞的方法。该方法只使用三种小分子化合物在15天内就能将80％的人多能干细胞分化为TBX18+/WT1+心外膜细胞。并且经过传代后这些细胞呈现典型的心外膜形态，并发生EMT分化为功能性平滑肌细胞和成纤维细胞。与前两种方法比较，该方法高效、稳定、成本低廉、分化过程不含免疫原成分，非常适合大规模分化及后期移植研究。更具体地，本专利技术提供以下各项：1.由多能干细胞制备心外膜细胞的方法，所述方法包括：1)通过激活WNT信号通路将所述多能干细胞诱导分化成中胚层细胞；2)通过抑制WNT信号通路使步骤1)中获得的中胚层细胞转化成心肌前体细胞；3)通过激活成纤维细胞生长因子信号通路和WNT信号通路使步骤2)中获得的心肌前体细胞转化成前心外膜细胞；以及4)由步骤3)中获得的前心外膜细胞制备心外膜细胞。2.根据1所述的方法，其中所述多能干细胞是人多能干细胞，优选地，所述人多能干细胞是人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞。3.根据1所述的方法，其中步骤1)中的激活WNT信号通路是通过添加WNT信号通路配体如WNT3a，或添加GSK-3抑制剂如CHIR99021、BIO，或添加与Axin有关的激动剂如HLY78来实现的，优选地，是通过添加CHIR99021来实现的。4.根据1所述的方法，其中步骤2)中的抑制WNT信号通路是通过添加内源性的WNT抑制因子如DKK1，或添加控制WNT信号和分泌的抑制剂如IWP2，或添加与β-catenin降解、Axin稳定相关的抑制剂如IWR1、XAV939来实现的，优选地，是通过添加IWR1来实现的。5.根据1所述的方法，其中步骤3)中的激活WNT信号通路是通过添加WNT信号通路配体如WNT3a，或添加GSK-3抑制剂如CHIR99021、BIO，或添加与Axin有关的激动剂如HLY78来实现的，优选地，是通过添加CHIR99021来实现的。6.根据1所述的方法，其中步骤3)中的激活成纤维细胞生长因子信号通路是通过添加成纤维细胞生长因子相关辅因子和结合蛋白来实现的，所述相关辅因子如硫酸乙酰肝素蛋白多糖Klotho家族蛋白，优选地，是通过添加硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)来实现的。7.根据1所述的方法，其中步骤3)中获得的前心外膜细胞是TBX18和WT1双阳性的前心外膜细胞。8.根据1所述的方法，其中在步骤4)中，将步骤3)中获得的前心外膜细胞经过低密度传代来制备心外膜细胞。9.通过1-8中任一项所述的方法制备的心外膜细胞。10.根据9所述的心外膜细胞用于心脏损伤修复的用途。11.制备心脏成纤维细胞的方法，所述方法包括：1)通过激活WNT信号通路将所述多能干细胞诱导分化成中胚层细胞；2)通过抑制WNT信号通路使步骤1)中获得的中胚层细胞转化成心肌前体细胞；3)通过激活成纤维细胞生长因子信号通路和WNT信号通路使步骤2)中获得的心肌前体细胞转化成前心外膜细胞；4)由步骤3)中获得的前心外膜细胞制备心外膜细胞；5)将步骤4)中获得的心外膜细胞用bFGF处理；以及6)将经过步骤5)的细胞用bFGF加胎牛血清处理。12.通过11所述的方法制备的心脏成纤维细胞。附图说明图1展示了人胚胎干细胞(hESC)向心肌前体细胞分化。qRT-PCR分析中胚层分子标记T和MESP1在分化第2天以及心肌前体细胞分子标记ISL1和NKX2.5在分化第5天细胞中的表达水平。基因的相对表达以看家基因TBP作为基因标准。图2展示了WNT信号促进心肌前体细胞向WT1+/cTnT本文档来自技高网...

【技术保护点】
由多能干细胞制备心外膜细胞的方法，所述方法包括：1)通过激活WNT信号通路将所述多能干细胞诱导分化成中胚层细胞；2)通过抑制WNT信号通路使步骤1)中获得的中胚层细胞转化成心肌前体细胞；3)通过激活成纤维细胞生长因子通路和WNT信号通路使步骤2)中获得的心肌前体细胞转化成前心外膜细胞；以及4)由步骤3)中获得的前心外膜细胞制备心外膜细胞。

【技术特征摘要】
1.由多能干细胞制备心外膜细胞的方法，所述方法包括：1)通过激活WNT信号通路将所述多能干细胞诱导分化成中胚层细胞；2)通过抑制WNT信号通路使步骤1)中获得的中胚层细胞转化成心肌前体细胞；3)通过激活成纤维细胞生长因子通路和WNT信号通路使步骤2)中获得的心肌前体细胞转化成前心外膜细胞；以及4)由步骤3)中获得的前心外膜细胞制备心外膜细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多能干细胞是人多能干细胞，优选地，所述人多能干细胞是人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞。3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤1)中的激活WNT信号通路是通过添加WNT信号通路配体如WNT3a，或添加GSK-3抑制剂如CHIR99021、BIO，或添加与Axin有关的激动剂如HLY78来实现的，优选地，是通过添加CHIR99021来实现的。4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤2)中的抑制WNT信号通路是通过添加内源性的WNT抑制因子如DKK1，或添加控制WNT信号和分泌的抑制剂如IWP2，或添加与β-catenin降解、Axin稳定相关的抑制剂如IWR1、XAV939来实现的，优选地，是通过添加IWR1来实现的。5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤3)中的激活WNT信号通路是通过添加WNT信号通路配体如WNT3a，或添加GSK-3抑制剂如CHIR...

【专利技术属性】
技术研发人员：王健，熊华强，宋彩霞，唐玲，
申请(专利权)人：重庆斯德姆生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆,50