一种基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法技术

一种基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法，所述微流控芯片构成如下：上层为液路控制层，下层为气路控制层，底面为空白玻璃底板。基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法的步骤依次如下：①芯片预处理；②细胞的接种与培养；③药物刺激；④荧光染色。所有液路层入口均由一个气路层的阀单独控制，可同时进行不同种类细胞培养、不同药物刺激以及不同抗体染色。本发明专利技术利用微流控芯片中的微流体与微型阀技术实现了在微流控芯片上的药物筛选与荧光染色，为细胞培养、细胞原位荧光染色以及药物筛选研究提供全新的技术平台。本发明专利技术操作简便、细胞与试剂用量少、高度集成化、应用范围广泛。

An integrated drug screening and dyeing method based on microfluidic chip

An integrated drug screening and dyeing method based on microfluidic chips. The microfluidic chip is composed of the upper layer is a liquid control layer, the lower layer is a gas control layer and the bottom is a blank glass floor. The steps of integrated drug screening and dyeing based on microfluidic chips are as follows: (1) chip preprocessing; (2) cell inoculation and culture; (3) drug stimulation; (4) fluorescence staining. All liquid level access is controlled by a single valve, which can be used for different cell culture, different drug stimulation and different antibody staining. The invention uses microfluidic and micro valve technology in microfluidic chip to realize drug screening and fluorescence staining on microfluidic chips, and provides a new technical platform for cell culture, cell in situ fluorescence staining and drug screening. The invention has the advantages of simple operation, small dosage of cell and reagent, high integration and wide application range.

【技术实现步骤摘要】
一种基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法
本专利技术涉及微流控技术与细胞生物学的交叉应用
，特别提供了一种基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法。
技术介绍
现有技术中，微流控芯片是一种在微小通道中操控微小体积流体流动的系统，其中通道的尺度为几十到几百微米，承载流体的量为10-9～10-18L。微流控芯片的各个操作单元通过微通道网络内流体的流动相互联系。微流体控制是微流控芯片实验室的操作核心，所涉及的进样、混合、反应、分离等过程都是在可控流体的运动中完成的。无论是宏观还是微观流体，阀都是流体控制的核心部件。由于其重要性，微型阀的研制早在微流控芯片诞生之前引起人们的广泛关注。理论上讲，凡是能控制微通道闭合和开启状态的部件均可作为微流控芯片中的微阀使用。一个理想的微阀应该具备以下特征：低泄漏、低功耗、响应速度快、线性操作能力和适应面广。微流体和微型阀构成了一套完整的微流控芯片系统。微流控分析的核心是利用微流控芯片将样品预处理、生物和化学反应、分离检测等基本操作单元集成在具有微米或纳米微通道网络的芯片上，通过操控流体完成复杂的分析过程，具有样品和试剂消耗量少、分析时间短、高通量、容易实现大规模平行测定等优点。利用微流控分析技术可方便的实现分析系统的小型化、集成化和便携化。目前，该系统被广泛应用在生命科学、疾病诊断与治疗、药物合成与筛选等领域。细胞水平药物筛选微流控芯片系统旨在通过设计有不同功能的芯片来培养细胞，对细胞施加药物刺激，并配合自动化的检测装置，采集药物与细胞相互作用的信号，收集数据，从而分析药物的作用，进行筛选并得到筛选结果。该系统的优点在于通过对样品全分析过程的微缩化和集成化，实现高灵敏的快速检测，高通量输出以及在线自动化操作等功能，较以往的细胞水平筛选技术表现出极大的优势，非常适合药物成分的筛选。免疫荧光染色技术是将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质定位的技术，是用于观察细胞内蛋白质分布和定位的普遍方法。免疫荧光染色的传统做法需要消耗大量的试剂，人力和时间，特别是某些珍贵抗体的消耗，限制了传统方法的使用。微流控芯片技术以其大大减少样品消耗，节省人工及时间成本，可在厘米见方的空间上实现自动化、高通量的实验等优势，受到了广泛的关注。人们迫切希望获得一种技术效果优良的集成化药物筛选与染色微流控芯片的制备方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种技术效果优良的基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法。以解决以往细胞药物筛选与染色过程中存在的操作步骤繁琐复杂、消耗大量试剂等技术局限。本专利技术提供了一种基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法，其特征在于：所述集成化药物筛选与染色微流控芯片由上层、下层、底面三层顺序串联贴合布置组成，其中：上层为液路控制层，下层为气路控制层，底面为空白玻璃底板；所述液路控制层具体设置有下述结构：——细胞荧光染色进样口：位于在整个液路控制层的最上游；——荧光染色进样通道区P1：布置在细胞荧光染色进样口和细胞进样通道区P2之间用于沟通二者；——细胞进样口：其设置有至少两个，每一个细胞进样口都设置在细胞进样通道区P2中的其中一条通道上，且前述细胞进样通道区P2中的每一条通道都串接着一个细胞培养室；——细胞进样通道区P2：设置在荧光染色进样通道区P1和细胞培养室之间；——细胞培养室：至少有二个，布置在细胞进样通道区P2和药物进样通道区P3之间；——药物进样通道区P3：其为包括覆盖所有细胞培养室和药物进样口之间的通道的区域；——药物进样口：其数量和细胞培养室相等，各自布置在每一个细胞培养室下游的通道上；——液体流出通道区P4：其布置在细胞培养室下游通道的下游和整个液路最尾端的出液口13之间；——出液口13：布置在整个液路控制层所有结构的最下游；基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法具体要求如下：细胞荧光染色步骤如下：①从各个药物进样口分别吸出药物溶液，从各个细胞进样口分别加入PBS冲洗2～5次，3～8min/次；②从各个细胞进样口分别加入0.04g/mL预冷的多聚甲醛固定细胞，PBS冲洗2～5次，3～8min/次；③从各个药物进样口分别吸去多聚甲醛，从各个细胞进样口分别加入PBS冲洗2～5次，3～8min/次；④从各个细胞进样口分别加入表面活性剂TritonX-100覆盖细胞10min，增加细胞膜的通透性，磷酸缓冲液PBS冲洗2～5次，3～8min/次；⑤从各个细胞进样口分别加入用血清封闭细胞15～60min；⑥在抗体加入之前，打开分别控制各个细胞进样口的气阀F～I和分别控制各个药物进样的气阀K～N；⑦打开用于控制细胞荧光染色进样口的气阀，将骨桥蛋白一抗从细胞荧光染色进样口流经荧光染色进样通道P1加入细胞培养室，孵育过夜；关闭用于控制细胞荧光染色进样口的气阀；打开用于控制细胞荧光染色进样口的气阀，从该气阀对应的细胞荧光染色进样口加入磷酸缓冲液PBS冲洗2～5次，3～8min/次；⑧次日，关闭控制细胞荧光染色进样口的气阀，打开另一控制细胞荧光染色进样口的气阀，将二抗从另一个细胞荧光染色进样口流经荧光染色进样通道P1加入细胞培养室，避光孵育0.5-3h；关闭前述用于引入二抗的细胞荧光染色进样口；打开用于控制细胞荧光染色进样口的气阀，从该气阀对应的细胞荧光染色进样口加入磷酸缓冲液PBS冲洗2～5次，3～8min/次；⑨关闭前述引入磷酸缓冲液PBS冲洗的用于控制细胞荧光染色进样口的气阀，打开另一控制细胞荧光染色进样口，将能够与DNA强力结合的荧光染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚DAPI从对应这一细胞荧光染色进样口入口引入并流经荧光染色进样通道P1加入细胞培养室；之后关闭前述用于控制细胞荧光染色进样口的气阀；打开前述引入磷酸缓冲液PBS冲洗的用于控制细胞荧光染色进样口的气阀，从对应的用于控制细胞荧光染色进样口加入磷酸缓冲液PBS清洗，通过荧光显微镜直观的观察细胞培养室中细胞经药物刺激后的生长状态以及荧光信号表达；⑩在⑦～⑨步骤中，当细胞荧光染色进样口进入的液体进入细胞培养室后，打开控制染料排出的阀五E、控制药物排出的阀六J；细胞荧光染色进样口进入的液体流经荧光染色进样通道P1和液体流出通道P4，从出液口13排出。所述集成化药物筛选与染色微流控芯片满足下述要求之一或其组合：其一，细胞荧光染色进样口设置有四个，其具体分别为：一抗入口1、二抗入口2、细胞核染料入口3、PBS缓冲液入口4；所述集成化药物筛选与染色微流控芯片中设置有四个以前述四个细胞荧光染色进样口为入口的通道，其相互并联并最终汇成一个共用的通道；最终汇成的共用通道再次一分为四，变成四条各自设置有一个细胞进样口的四条通道，每个细胞进样口还分别依次连接着下游的细胞培养室、药物进样口和再之后的液体流出通道P4；所述四个细胞进样口分别为：细胞进样口一5、细胞进样口二6、细胞进样口三7、细胞进样口四8；与前述四个细胞进样口依次对应处于同一液体通路上的四个细胞培养室分别是：细胞培养室一R1、细胞培养室二R2、细胞培养室三R3、细胞培养室四R4；同样的，对应的四个药物进样口分别依次是：药物进样口一9、药物进样口二10、药物进样口三11、药物进样口四12；其二，液体流出通道区P4：其是将细胞培养室本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法，其特征在于：所述集成化药物筛选与染色微流控芯片由上层、下层、底面三层顺序串联贴合布置组成，其中：上层为液路控制层，下层为气路控制层，底面为空白玻璃底板，；所述液路控制层具体设置有下述结构：——细胞荧光染色进样口：位于在整个液路控制层的最上游；——荧光染色进样通道区(P1)：布置在细胞荧光染色进样口和细胞进样通道区(P2)之间用于沟通二者；——细胞进样口：其设置有至少两个，每一个细胞进样口都设置在细胞进样通道区(P2)中的其中一条通道上，且前述细胞进样通道区(P2)中的每一条通道都串接着一个细胞培养室；——细胞进样通道区(P2)：设置在荧光染色进样通道区(P1)和细胞培养室之间；——细胞培养室：至少有二个，布置在细胞进样通道区(P2)和药物进样通道区(P3)之间；——药物进样通道区(P3)：其为包括覆盖所有细胞培养室和药物进样口之间的通道的区域；——药物进样口：其数量和细胞培养室相等，各自布置在每一个细胞培养室下游的通道上；——液体流出通道区(P4)：其布置在细胞培养室下游通道的下游和整个液路最尾端的出液口(13)之间；——出液口(13)：布置在整个液路控制层所有结构的最下游；基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法具体要求如下：细胞荧光染色步骤如下：①从各个药物进样口分别吸出药物溶液，从各个细胞进样口分别加入PBS冲洗2～5次，3～8min/次；②从各个细胞进样口分别加入0.04g/mL预冷的多聚甲醛固定细胞，PBS冲洗2～5次，3～8min/次；③从各个药物进样口分别吸去多聚甲醛，从各个细胞进样口分别加入PBS冲洗2～5次，3～8min/次；④从各个细胞进样口分别加入表面活性剂Triton X‑100覆盖细胞10min，增加细胞膜的通透性，磷酸缓冲液冲洗2～5次，3～8min/次；⑤从各个细胞进样口分别加入血清封闭细胞15～60min；⑥在抗体加入之前，打开分别控制各个细胞进样口的气阀和分别控制各个药物进样的气阀；⑦打开用于控制细胞荧光染色进样口的气阀，将骨桥蛋白一抗从细胞荧光染色进样口流经荧光染色进样通道(P1)加入细胞培养室，孵育过夜；关闭用于控制细胞荧光染色进样口的气阀；打开用于控制细胞荧光染色进样口的气阀，从该气阀对应的细胞荧光染色进样口加入磷酸缓冲液冲洗2～5次，3～8min/次；⑧次日，关闭控制细胞荧光染色进样口的气阀，打开另一控制细胞荧光染色进样口的气阀，将二抗从另一个细胞荧光染色进样口流经荧光染色进样通道(P1)加入细胞培养室，避光孵育0.5‑3h；关闭前述用于引入二抗的细胞荧光染色进样口；打开用于控制细胞荧光染色进样口的气阀，从该气阀对应的细胞荧光染色进样口加入磷酸缓冲液冲洗2～5次，3～8min/次；⑨关闭前述引入磷酸缓冲液冲洗的用于控制细胞荧光染色进样口的气阀，打开另一控制细胞荧光染色进样口，将能够与DNA强力结合的荧光染料4',6‑二脒基‑2‑苯基吲哚从对应这一细胞荧光染色进样口入口引入并流经荧光染色进样通道(P1)加入细胞培养室；之后关闭前述用于控制细胞荧光染色进样口的气阀；打开前述引入磷酸缓冲液冲洗的用于控制细胞荧光染色进样口的气阀，从对应的用于控制细胞荧光染色进样口加入磷酸缓冲液清洗，通过荧光显微镜直观的观察细胞培养室中细胞经药物刺激后的生长状态以及荧光信号表达。...

【技术特征摘要】
1.一种基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法，其特征在于：所述集成化药物筛选与染色微流控芯片由上层、下层、底面三层顺序串联贴合布置组成，其中：上层为液路控制层，下层为气路控制层，底面为空白玻璃底板，；所述液路控制层具体设置有下述结构：——细胞荧光染色进样口：位于在整个液路控制层的最上游；——荧光染色进样通道区(P1)：布置在细胞荧光染色进样口和细胞进样通道区(P2)之间用于沟通二者；——细胞进样口：其设置有至少两个，每一个细胞进样口都设置在细胞进样通道区(P2)中的其中一条通道上，且前述细胞进样通道区(P2)中的每一条通道都串接着一个细胞培养室；——细胞进样通道区(P2)：设置在荧光染色进样通道区(P1)和细胞培养室之间；——细胞培养室：至少有二个，布置在细胞进样通道区(P2)和药物进样通道区(P3)之间；——药物进样通道区(P3)：其为包括覆盖所有细胞培养室和药物进样口之间的通道的区域；——药物进样口：其数量和细胞培养室相等，各自布置在每一个细胞培养室下游的通道上；——液体流出通道区(P4)：其布置在细胞培养室下游通道的下游和整个液路最尾端的出液口(13)之间；——出液口(13)：布置在整个液路控制层所有结构的最下游；基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法具体要求如下：细胞荧光染色步骤如下：①从各个药物进样口分别吸出药物溶液，从各个细胞进样口分别加入PBS冲洗2～5次，3～8min/次；②从各个细胞进样口分别加入0.04g/mL预冷的多聚甲醛固定细胞，PBS冲洗2～5次，3～8min/次；③从各个药物进样口分别吸去多聚甲醛，从各个细胞进样口分别加入PBS冲洗2～5次，3～8min/次；④从各个细胞进样口分别加入表面活性剂TritonX-100覆盖细胞10min，增加细胞膜的通透性，磷酸缓冲液冲洗2～5次，3～8min/次；⑤从各个细胞进样口分别加入血清封闭细胞15～60min；⑥在抗体加入之前，打开分别控制各个细胞进样口的气阀和分别控制各个药物进样的气阀；⑦打开用于控制细胞荧光染色进样口的气阀，将骨桥蛋白一抗从细胞荧光染色进样口流经荧光染色进样通道(P1)加入细胞培养室，孵育过夜；关闭用于控制细胞荧光染色进样口的气阀；打开用于控制细胞荧光染色进样口的气阀，从该气阀对应的细胞荧光染色进样口加入磷酸缓冲液冲洗2～5次，3～8min/次；⑧次日，关闭控制细胞荧光染色进样口的气阀，打开另一控制细胞荧光染色进样口的气阀，将二抗从另一个细胞荧光染色进样口流经荧光染色进样通道(P1)加入细胞培养室，避光孵育0.5-3h；关闭前述用于引入二抗的细胞荧光染色进样口；打开用于控制细胞荧光染色进样口的气阀，从该气阀对应的细胞荧光染色进样口加入磷酸缓冲液冲洗2～5次，3～8min/次；⑨关闭前述引入磷酸缓冲液冲洗的用于控制细胞荧光染色进样口的气阀，打开另一控制细胞荧光染色进样口，将能够与DNA强力结合的荧光染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚从对应这一细胞荧光染色进样口入口引入并流经荧光染色进样通道(P1)加入细胞培养室；之后关闭前述用于控制细胞荧光染色进样口的气阀；打开前述引入磷酸缓冲液冲洗的用于控制细胞荧光染色进样口的气阀，从对应的用于控制细胞荧光染色进样口加入磷酸缓冲液清洗，通过荧光显微镜直观的观察细胞培养室中细胞经药物刺激后的生长状态以及荧光信号表达。2.按照权利要求1所述基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法，其特征在于：所述基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法还有步骤⑩：在⑦～⑨步骤中，当细胞荧光染色进样口进入的液体进入细胞培养室后，打开控制染料排出的阀五(E)、控制药物排出的阀六(J)；细胞荧光染色进样口进入的液体流经荧光染色进样通道(P1)和液体流出通道(P4)，从出液口(13)排出。3.按照权利要求1所述基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法，其特征在于：所述集成化药物筛选与染色微流控芯片还满足下述要求之一或其组合：其一，细胞荧光染色进样口设置有四个，其具体分别为：一抗入口(1)、二抗入口(2)、细胞核染料入口(3)、PBS缓冲液入口(4)；所述集成化药物筛选与染色微流控芯片中设置有四个以前述四个细胞荧光染色进样口为入口的通道，其相互并联并最终汇成一个共用的通道；最终汇成的共用通道再次一分为四，变成四条各自设置有一个细胞进样口的四条通道，每个细胞进样口还分别依次连接着下游的细胞培养室、药物进样口和再之后的液体流出通道(P4)；所述四个细胞进样口分别为：细胞进样口一(5)、细胞进样口二(6)、细胞进样口三(7)、细胞进样口四(8)；与前述四个细胞进样口依次对应处于同一液体通路上的四个细胞培养室分别是：细胞培养室一(R1)、细胞培养室二(R2)、细胞培养室三(R3)、细胞培养室四(R4)；同样的，对应的四个药物进样口分别依次是：药物进样口一(9)、药物进样口二(10)、药物进样口三(11)、药物进样口四(12)；其二，液体流出通道区(P4)：其是将细胞培养室下游的四条通道合并为最终的共用的一个出液口(13)的通道合并区域；其三，所述微流控芯片的下层即气路控制层具体由泵阀控制区组成，每个荧光染色液体入口有单独的泵阀单元控制，以使进样液体互相不影响；气路控制层具体包含有下述结构之一或其组合：依次设置在前述四个细胞进样口即细胞进样口一(5)、细胞进样口二(6)、细胞进样口三(7)、细胞进样口四(8)上游的控制用的阀：阀七(F)、阀八(G)、阀九(H)、阀十(I)；依次设置在前述...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦建华，张晓庆，姜雷，苏文涛，石杨，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21