抗VEGF抗体制造技术

本发明专利技术公开了特异性结合血管内皮生长因子(VEGF)的抗体，特别是重链抗体，更特别是单域抗体。还公开了所述抗体的制备方法和治疗用途。

Anti VEGF antibody

The invention discloses antibodies specifically binding vascular endothelial growth factor (VEGF), especially heavy chain antibodies, especially single domain antibodies. The preparation method and therapeutic use of the antibody are also disclosed.

【技术实现步骤摘要】
抗VEGF抗体本申请为申请号为201510004038.0的专利技术专利申请的分案申请，原申请日为2015年01月06日，公开日为2016年08月03日，专利技术名称为“抗VEGF抗体”。
本专利技术涉及抗体及其应用，具体而言，本专利技术涉及特异性结合血管内皮生长因子(VascularEndothelialGrowthFactor,VEGF)的抗体，特别是重链抗体，更特别是单域抗体；以及所述抗体的制备方法和治疗用途。
技术介绍
血管生成是指从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展而形成新的血管，是一个涉及多种细胞的多种分子的复杂过程。血管生成是促血管形成因子和抑制因子协调作用的复杂过程，正常情况下二者处于平衡状态，一旦此平衡打破就会激活血管系统，使血管生成过度或抑制血管系统使血管退化。已知许多疾病与血管生成失控和不希望有的血管生成有关。这些疾病包括但不限于肿瘤如所谓的实体瘤和液体(或血液)瘤(如白血病和淋巴瘤)，炎症如类风湿或风湿性炎症，尤其是关节炎(包括类风湿性关节炎)，或其它慢性炎症如慢性哮喘，动脉硬化或移植后动脉硬化、子宫内膜异位，眼新生血管疾病，如视网膜病(包括糖尿病视网膜病)、老年黄斑变性、牛皮癣、成血管细胞瘤、血管瘤、动脉硬化。其它与血管生成失控和不希望有的血管生成有关的疾病对本领域技术人员是显然的。血管内皮生长因子，是对血管内皮细胞具有特异性的肝素结合生长因子，可在体内诱导血管新生。包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F和胎盘生长因子。VEGF-A的主要作用为促进血管内皮细胞增殖、迁移和管腔的形成，同时也会增加血管渗漏、促进单核细胞趋化和B细胞生成。VEGF-A的生物学效应是依靠与其特异性受体结合而介导的，与其结合的主要是特异性受体血管内皮生长因子受体1(VEGFR-1)和VEGFR-2。其中，VEGFR-2被认为是主要的VEGFR，其对血管内皮细胞的增生有重要影响。VEGFR-2通过细胞内激酶诱导VEGF绑定二聚体和需要自身磷酸化的受体，从而加强细胞的有丝分裂(KlettnerA,RoiderJ.Treatingage-relatedmaculardegenerationinteractionofVEGF-antagonistswiththeirtarget.MiniRevMedChem,2009,9(9):1127-1135)。VEGF-A包括8个外显子和7个内含子，其转录剪接成多个亚型，主要为：VEGF121、VEGF145、VEGF206、VEGF165、VEGF189，这些亚型有不同的分子质量、溶解度和肝素结合能力，其中VEGF165是VEGF-A最主要的亚型(FerraraN,GerberHP,LeCouterJ.ThebiologyofVEGFanditsreceptors.NatMed,2003,9(6):669-676)。VEGF165是分泌型可溶性蛋白，能直接作用于血管内皮细胞促进血管内皮细胞增殖，加速血管内皮细胞损伤的修复，增加血管通透性，使血管内血栓形成及血栓性闭塞减少，并抑制内膜增生(黄晨星,沈祖光.血管内皮生长因子的研究及在组织修复中的应用J.中国修复重建外科杂志.2002,160:64–68)。现有的血管内皮生长因子药物包括哌加他尼钠(Pegaptanibsodium，商品名Macugen)、Ranibizumab(商品名为Lucentis)、贝伐单抗(Bevacizumab，商品名为Avastin)、VEGFTrap等。目前针对抗VEGF制剂争议的焦点是可能加重组织纤维膜的形成。目前临床用于治疗多种疾病(如年龄相关性黄斑变性)的抗VEGF药物，需要频繁进行眼内注药，导致发生眼内炎的潜在风险，这是抗VEGF治疗存在的明显问题。有研究者使用脐静脉内皮细胞和Tenon囊的纤维细胞，观察倍伐单抗和Macugen对VEGF不同亚型的作用，结果证实VEGF-165、VEGF-121主要影响血管生长，VEGF-189主要影响纤维化形成过程。倍伐单抗和雷珠单抗能抑制全部有活性的VEGF-A亚型(VanBergenT,VandewalleE,VandeVeireS,eta1.TheroleofdifferentVEGFisoformsinscarformationafterglaucomafiltrationsurgery.ExpEyeRes,2011,93:689-699；andCATTresearchgroup,MartinDF,MaguireMG,etal.RanibizumabandBevacizumabforneovascularage-relatedmaculardegeneration.NEnglJMed,2011.364:1897-1908)，这可能是倍伐单抗导致某些患者玻璃体腔内纤维化的原因。目前抗VEGF的药物每4～6周需要重复治疗,雷珠单抗治疗第1年的平均年注射量约6.9次，倍伐单抗约7.7次(LiX,HuY,SunX,ZhangJ,ZhangM.Bevacizumabforneovascularage-relatedmaculardegenerationinChina.Ophthalmology.2012Oct.,119(10):2087-93)，如此频繁的眼内注药治疗存在发生眼内炎的潜在风险，急需开发药效长，视网膜通透吸收更好的新型抗体药物，以延长给药周期，降低注射给药给患者带来的不适与风险。除此之外，目前抗VEGF制剂表达纯化工艺复杂，普遍存在成本高，稳定性差、应用面不广等现实问题。重链抗体是从骆驼科动物的血清中分离出的一种抗体，仅由重链构成，其抗原结合区仅是一个通过铰链区与Fc区连接的单结构域，而且这个抗原结合区自抗体上分离后仍具有结合抗原的功能，故称为单域抗体(single-domainantibody,sdAb)或纳米抗体(nanobody)。与传统抗体不同的是，单域抗体是一个含有大约110个氨基酸的肽链，其分子量约为传统抗体的1/10，这就为抗体的分子构建提供了一个新方法(Muyldermans.Singledomaincamelantibodies:currentstatus.JBiotechnol2001,74:277-302)。这类单域抗体具有分子小、热稳定性好、在清洁剂和高浓度尿酸环境下稳定、体内组织渗透性好、可溶性好(StanfieldR,DooleyH,FlajnikM,WilsonI.Crystalstructureofasharksingle-domainantibodyVregionincomplexwithlysozyme.Science.2004,305(5691))、易表达、利于原核系统表达、生产成本低、抗原识别表位独特，且能识别隐藏的抗原性位点等特性，在免疫实验、诊断与治疗中，逐渐发挥着超乎想象的巨大功能(DirkSaerens,GholamrezaHassanzadehGhassabeh,SergeMuyldermans.Single-domainantibodiesasbuildingblocksfornoveltherapeutics.CurrentOpinio本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗VEGF抗体，其特征在于：其由重链可变区和Fc片段组成，Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示。

【技术特征摘要】
1.一种抗VEGF抗体，其特征在于：其由重链可变区和Fc片段组成，Fc片段的氨基酸序列如SEQIDNO：20所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO：13所示。2.一种核酸，其编码权利要求1中的重链可变区，其序列如SEQIDNO：18所...

【专利技术属性】
技术研发人员：方海洲，曲伟，郑赞顺，庄兰芳，王新志，
申请(专利权)人：珠海亿胜生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44