一种环孢菌素H的分离纯化方法技术

一种环孢菌素H的分离纯化方法，其中层析柱采用了苯基氨基甲酸酯化β‑环糊精硅胶作为层析柱的填料，进行环孢菌素H的分离纯化，可将原料中的环孢菌素A和环孢菌素H进行有效分离。同时分离纯化过程中，可使用单一极性溶剂，可对溶剂进行回收利用，节约生产成本。洗脱过程中，含有环孢菌素H的交叉部分还可以回收重新纯化，避免造成浪费。同时，该技术方案适用于各种含环孢菌素H的原料,适用性强，可大量制备，可为医药工业提供大量高纯度的环孢菌素H原材料。

A method for isolation and purification of cyclosporin H

A separation and purification method for cyclosporin H, in which phenyl carbamate beta cyclodextrin silica gel was used as a filler for chromatography column, was used to separate and purify cyclosporin H, and the cyclosporin A and cyclosporin H could be effectively separated. In the process of separation and purification, a single polar solvent can be used to recycle the solvent and save production cost. During the elution process, the cross section containing cyclosporin H can also be recovered and repurified so as to avoid waste. At the same time, the technical scheme is suitable for all kinds of materials containing cyclosporin H, which is strong and can be prepared in large quantities. It can provide a large number of high purity cyclosporin H raw materials for the pharmaceutical industry.

【技术实现步骤摘要】
一种环孢菌素H的分离纯化方法
本专利技术涉及生物化学领域，特别涉及一种环孢菌素H的分离纯化方法。
技术介绍
环孢菌素(Cyclosporin)是20世纪70年代发现的由雪白白僵菌(Beauveriabassiana，原名为多孔木霉菌Tolypocladiuminflatum)产生的一组环状十一肽物质。其中的一个主要组分一环孢素A(CyclosporinA,CsA)己作为高效免疫抑制剂广泛应用于器官移植术，环孢素A结构图与结构式可见图1。它的问世引起了器官移植领域的一场革命。除免疫抑制作用外，环孢素还有一系列其它生物活性，如治疗红斑狼疮、牛皮癣等自身免疫系统疾病，抑制HIV-1病毒，逆转肿瘤多药耐药等。环孢菌素H(CyclosporinH,CsH)结构图与结构式可见图2，与CsA都是首先从半知菌属多孔木霉(Tolypocladiuminflatum后正名为雪白白僵菌Beauveriabassiana)代谢产物中分离出来的。CsH的化学结构和CsA相似，都是由十一个氨基酸组成的环状多肽，只是第十一位上的甲基缬氨酸(MeVal)的构型不同，在CsA中为L构型，在CsH中为D构型。CsH无免疫抑制活性，但在逆转肿瘤多药耐药、抗寄生虫以及抗病毒方面与CsA有相似的作用，特别是在对G-蛋白偶联受体(GPCR)－甲酰肽受体(FPR)功能的拮抗作用方面大大强于CsA，也强于许多其他甲酰肽受体拮抗剂，引起科学家广泛的注意。此外，CsH已经用于研究其它的一些生物过程，包括程序性死亡、K+离子通道的功能性表达、Ca+在血管平滑肌可能的作用、一氧化氮(NO)合成酶活性、病毒诱导的细胞调亡、肿瘤和获得性免疫缺陷综合症(HIV)等。目前，环孢菌素H来源主要有两个途径：1、依据美国专利pat20120253007，SynthesisofCyclosporinH的报道方法，将CsA转换为CsH，但先分离出CsA，再进行CsH的转换，步骤繁琐，收率较低。2、从多孔木霉的发酵液经过滤或离心分离,滤液用乙酸丁酯提取,提取物除脂后得到环孢菌素的混合物,再经硅胶柱层析后经分部收集、去色素、减压浓缩和干燥得到白色CsH粉末。图3、图4分别是由两种发酵粗提取物环孢菌素H的HPLC图，其中环孢菌素H含有不同比例，有2.7％也有4.1％(RT79min)。从发酵粗提取物HPLC在210nm下可以看到含有的杂质大概分布情况，较难快速获得高纯度的环孢菌素H。其中，这两种发酵粗提取物一般是经过不同的层析作为环孢菌素A的生产原料。但由于发酵副产物较多，提取步骤复杂，收率较低。图5是由环孢菌素A合成制备的环孢菌素H的HPLP图，其中环孢菌素H含量为21.4％。目前获得环孢菌素H的主要方法用硅胶或者ODS-C18色谱填料对以上环孢菌素粗品进行提纯，但分离度效果不好、收率低且繁琐。有研究报道，可采用大孔树脂结合高速逆流色谱分离纯化的方法，分离中交叉组分大，纯化周期长，不适合放大。在《茄病镰刀菌产生的环孢菌素H的研究----分离纯化和结构鉴别》提供了硅胶层析柱分离纯化方法和HPLC检测条件，ODS-C18，4.6*250mm，5μm，1ml/min，乙腈：水：叔丁基甲醚：磷酸＝50：45：5：0.1，紫外210nm，80℃。在技术专利《一种环孢菌素同系物的分离纯化装置》CN205838893U中提供了一种环孢菌素同系物的分离纯化装置，该方法主要利用至少两级切向层析柱分离纯化单元的系统，该系统主要是适用于硅胶填料或者氧化铝填料介质，设备系统复杂且设置多处压力泵和洗脱体系，难适用于反相层析方式。在专利《高纯度环孢菌素A的制备方法》CN1763084报道了使用丙酮、水和正己烷长时间粗结晶以及结合硅胶层析纯化然后再结晶得到纯度高的环孢菌素A，和《一种制备环孢菌素A的方法》CN102086226A中，则使用了大孔吸附树脂层析、硅胶柱层析、结晶纯化得到纯度高的环孢菌素A，由工业生产上环孢菌素A发酵的参考相关文献：《发酵液中小组分环孢菌素D的HPLC测定法》《果葡糖浆对环孢菌素A发酵影响的研究》《环孢菌素A发酵生产方法》《环孢菌素A产生菌诱变育种及发酵条件研究》《雪白白僵菌产环孢菌素A分批补料发酵动力学》可知一般环孢菌素A的组分初始占总纯度都会大于85％，以及后续的纯化生产才能获得有价值的环孢菌素A纯品。对于发酵粗品中本身含有的杂质小组分环孢菌素H的获得还较难获得规模化生产，一般都是通过环孢菌素A生产的边角料，经过多次富集纯化，提高含量后再进行纯化获得，专利pat20120253007和其参考文献报道的合成转换方法获得的粗品是一种有效可控的环孢菌素H获得来源，但纯化也过于繁琐收率较低。同时，合适的结晶溶剂体系会对产品的纯度和晶型起关键的作用，结晶和重结晶也是一种重要的提高产品纯度的方式。
技术实现思路
为此，需要提供一种高收率，高纯度的环孢菌素H的分离纯化方法，特别是将环孢菌素H与环孢菌素A进行分离纯化的方法。为实现上述目的，专利技术人提供了一种环孢菌素H的分离纯化方法，包括以下步骤：待分离液的制备：将环孢菌素H含量10％以上的环孢菌素H粗品溶解于极性溶剂，过滤后得到含环孢菌素H的溶液，按溶液体积比15-25％加入水进行搅拌稀释，制成待分离液；上样：将待分离液上样层析柱，形成含有环孢菌素H的层析柱；所述层析柱制备包括：将苯基氨基甲酸酯化β-环糊精硅胶用甲醇浸泡后装柱，再用体积百分比浓度35-40％的极性溶剂平衡层析柱；洗脱：用洗脱液对层析柱进行梯度洗脱，所述洗脱液中含有质量百分比为0.1％的甲酸或乙酸，所述洗脱液中极性溶剂的体积百分比浓度由35-40％逐步提高至45-50％，洗脱流速为每小时3-5个柱体积，用HPLC进行跟踪监测，收集环孢菌素H含量95％以上的洗脱液；浓缩结晶：将洗脱步骤中收集的环孢菌素H含量95％以上的洗脱液进行浓缩，浓缩后产物用乙酸乙酯进行萃取，并取上相萃取液减压浓缩后得到稠状浓缩物，稠状浓缩物加入丙酮溶解过滤后，再依次加入甲基叔丁基醚和去离子水，最后逐步加入正己烷至溶液中出现白色不溶物后，降温至4℃，析出白色固体；干燥：过滤浓缩结晶步骤中析出的白色固体，将白色固体在40-60℃下进行干燥，得到环孢菌素H成品。优选的，所述环孢菌素H粗品中含有环孢菌素A。优选的，所述极性溶剂为乙腈、甲醇、乙醇的一种或者多种。优选的，所述待分离液的制备步骤中，所述环孢菌素H粗品与所述极性溶剂的重量比为1：8-12。优选的，所述环孢菌素H粗品与所述苯基氨基甲酸酯化β-环糊精硅胶的重量比为1：10-100。优选的，所述层析柱的径高比大于10。优选的，所述浓缩结晶步骤中，将洗脱步骤中收集的环孢菌素H含量95％以上的洗脱液减压浓缩至无极性溶剂后，再用乙酸乙酯进行萃取。优选的，所述浓缩结晶步骤中，将洗脱步骤中收集的环孢菌素H含量95％以上的洗脱液用截留分子量不大于200的聚醚砜纳滤膜进行浓缩，浓缩至原体积的五分一后，再用乙酸乙酯进行萃取。优选的，所述浓缩结晶步骤中，所述稠状浓缩物与丙酮、甲基叔丁基醚、去离子水的重量比为1:1-3：1:0.001。优选的，所述浓缩结晶步骤中，所述稠状浓缩物与正己烷的体积比为1:4-6。区别于现有技术，上述技术方案的层析柱采用了苯基氨基甲酸酯化β-环糊精本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种环孢菌素H的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：待分离液的制备：将环孢菌素H含量10％以上的环孢菌素H粗品溶解于极性溶剂，过滤后得到含环孢菌素H的溶液，按溶液体积比15‑25％加入水进行搅拌稀释，制成待分离液；上样：将待分离液上样层析柱，形成含有环孢菌素H的层析柱；所述层析柱的制备包括：将苯基氨基甲酸酯化β‑环糊精硅胶用甲醇浸泡后装柱，再用体积百分比浓度35‑40％的极性溶剂平衡层析柱；洗脱：用洗脱液对层析柱进行梯度洗脱，所述洗脱液中含有质量百分比为0.1％的甲酸或乙酸，所述洗脱液中极性溶剂的体积百分比浓度由35‑40％逐步提高至45‑50％，洗脱流速为每小时3‑5个柱体积，用HPLC进行跟踪监测，收集环孢菌素H含量95％以上的洗脱液；浓缩结晶：将洗脱步骤中收集的环孢菌素H含量95％以上的洗脱液进行浓缩，浓缩后产物用乙酸乙酯进行萃取，并取上相萃取液减压浓缩后得到稠状浓缩物，稠状浓缩物加入丙酮溶解过滤后，再依次加入甲基叔丁基醚和去离子水，最后逐步加入正己烷至溶液中出现白色不溶物后，降温至4℃，析出白色固体；干燥：过滤浓缩结晶步骤中析出的白色固体，将白色固体在40‑60℃下进行干燥，得到环孢菌素H成品。...

【技术特征摘要】
1.一种环孢菌素H的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：待分离液的制备：将环孢菌素H含量10％以上的环孢菌素H粗品溶解于极性溶剂，过滤后得到含环孢菌素H的溶液，按溶液体积比15-25％加入水进行搅拌稀释，制成待分离液；上样：将待分离液上样层析柱，形成含有环孢菌素H的层析柱；所述层析柱的制备包括：将苯基氨基甲酸酯化β-环糊精硅胶用甲醇浸泡后装柱，再用体积百分比浓度35-40％的极性溶剂平衡层析柱；洗脱：用洗脱液对层析柱进行梯度洗脱，所述洗脱液中含有质量百分比为0.1％的甲酸或乙酸，所述洗脱液中极性溶剂的体积百分比浓度由35-40％逐步提高至45-50％，洗脱流速为每小时3-5个柱体积，用HPLC进行跟踪监测，收集环孢菌素H含量95％以上的洗脱液；浓缩结晶：将洗脱步骤中收集的环孢菌素H含量95％以上的洗脱液进行浓缩，浓缩后产物用乙酸乙酯进行萃取，并取上相萃取液减压浓缩后得到稠状浓缩物，稠状浓缩物加入丙酮溶解过滤后，再依次加入甲基叔丁基醚和去离子水，最后逐步加入正己烷至溶液中出现白色不溶物后，降温至4℃，析出白色固体；干燥：过滤浓缩结晶步骤中析出的白色固体，将白色固体在40-60℃下进行干燥，得到环孢菌素H成品。2.根据权利要求1所述的一种环孢菌素H的分离纯化方法，其特征在于，所述环孢菌素H粗品中含有环孢菌素A。3.根据权利要求1所述的一种环孢菌素H的分离纯化方...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈秀明，乐占线，江莉，
申请(专利权)人：陈秀明，
类型：发明
国别省市：福建,35