用于确定纤维蛋白原的方法技术

本发明专利技术涉及凝血诊断并涉及一种用于根据Clauss方法确定人体血浆样本的纤维蛋白原浓度的动力学方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于确定纤维蛋白原的方法
本专利技术涉及凝血诊断领域并且涉及一种用于根据Clauss方法确定人体血浆样本中的纤维蛋白原浓度的方法。
技术介绍
纤维蛋白原是纤维蛋白的水溶性前身，纤维蛋白形成用于伤口愈合的基质。凝血蛋白酶Thrombin(因子IIa)使纤维蛋白原分裂并且以该方式激活纤维蛋白形成、即血块形成。降低的纤维蛋白原水平伴随着出血倾向。急剧升高的纤维蛋白原水平通常出现在发炎、术后或其它的情况中。长期升高的纤维蛋白原水平适合作为血栓疾病的风险指标。在现有技术中已知了用于确定纤维蛋白原浓度的一系列不同方法。在CA1062501中描述了基于对凝血酶时间进行测量的纤维蛋白原确定方法，其中，凝血酶时间已知不能实现精确地确定纤维蛋白原浓度，因为除了纤维蛋白原之外还有另外的因素、例如抗凝血剂(如肝素)或直接的凝血酶抑制剂又或者存在能够影响凝血酶时间的纤维蛋白或纤维蛋白原分裂物，并且凝血酶时间通常仅在纤维蛋白原严重不足的状态下起作用。在凝血酶时间方法中，通常以较小的凝血酶数量混合未稀释的血浆样本，并且光度地测量纤维蛋白形成、即反应混合物的吸光变化并且随后确定凝血时间。然而，根据CA1062501不确定凝血时间，而是确定反应曲线的一阶导数的最大值，或者换句话说反应曲线的最大吸光变化。所发现的是，最大吸光变化与纤维蛋白原浓度呈线性相关，从而后者能够借助于校准曲线来确定，该校准曲线从已知的纤维蛋白原浓度与最大吸光变化的对应关系来建立。用于确定纤维蛋白原浓度的基本上精确并且经常应用的方法是所谓的Clauss方法(Clauss，A.，用于确定纤维蛋白原的凝血生理学的快速方法。1957年，Actahaemat.17：237-246)。该测试是凝血酶时间的变体方案，其中血浆样本与凝血酶混合并且确定凝血时间。在Clauss方法中，在反应混合物中，较低的纤维蛋白原浓度与较高的标准化的凝血酶浓度组合，由此纤维蛋白形成速度在实际上仅与纤维蛋白原浓度相关。反应混合物中的相对较低的纤维蛋白原浓度通常通过应用事先稀释的血浆样本建立。在反应混合物中随后光度地确定纤维蛋白形成、即血块形成。由于纤维蛋白形成使得反应混合物浊度增加，从而能够通过吸收测量定量地测量纤维蛋白形成。随后，通常确定样本的凝血时间。样本的凝血时间与纤维蛋白原数量成比例。样本的凝血时间是从凝血酶加入样本的时间点到测量到可辨认的纤维蛋白形成、即反应混合物的浊度的时间点的时间。在此，“可辨认的纤维蛋白形成”能够限定为测试和设备专用的阈值，该阈值-当超过其的时候-表明了凝血时间。可替换地，从凝血反应开始之前与结束之后的信号差出发，“可辨认的纤维蛋白形成”能够限定为测试和设备专用的百分比信号差值，其-当超过其的时候-表明了凝血时间。Clauss测试中的纤维蛋白形成的反应动力学与凝血酶时间测试中的纤维蛋白形成的反应动力学明显不同。在Clauss测试中，在添加了凝血酶试剂之后3秒，已经开始了取决于纤维蛋白原浓度的纤维蛋白形成，即明显早于在凝血酶时间测试中最早在10秒后才实现的纤维蛋白形成。此外，在Clauss测试中，纤维蛋白形成速度至少在浓度比较高的样本中高于凝血酶时间测试的情况。因此，与凝血酶时间测试相比，Caluss测试中的具有高纤维蛋白原浓度的样本的反应曲线的特征在于较短的迟滞期、陡峭的上升和相对较快地到达稳定阶段。与凝血酶时间测试相比，Caluss测试中的具有低纤维蛋白原浓度的样本的反应曲线的特征在于同样较短的迟滞期、平缓的上升和主要在结束测量之后才迟迟进入的稳定阶段。相对而言，在凝血酶时间中，稳定阶段很不明显或者甚至完全没有。问题在于，由于Caluss测试中的血浆样本的相对较高的稀释度而仅获得相对较低的信号强度，这种信号强度能够由于光学系统中较低的信噪比和已经由于轻微的干扰(例如反应混合物中的能够由于应用冷却的试剂产生的气泡)而导致不精确的测量结果。为了避免该问题，在现有技术中应用未冷却的试剂，和/或添加陶土作为增强信号的附加试剂。应用未冷却的试剂的缺点在于，试剂具有减少的稳定性并且会尽可能快地耗尽。此外，在现代的分析设备中，常常为试剂储存器仅设置冷却的保存位置，从而甚至不能够设置未冷却的试剂。应用增强信号的附加试剂同样是不期望的，一方面出于经济原因，并且另一方面，因为由于附加要求的移液步骤而延长了测试的处理。此外，所形成的血块特别是在血浆纤维蛋白原水平较低的情况下呈球状并且作为“纤维蛋白陶土球”在反应混合物中四处飘散。此外的问题在于，在Clauss测试中确定样本的凝血时间时理想地应当在将凝血酶添加给样本之后立即开始测量。然而实际上，在分析设备上自动化地执行时，在将凝血酶试剂添加到反应容器中与反应容器沉淀到测量位置之间经过了短时间间隔(几秒钟)。然而，在血浆纤维蛋白原水平的非常高的情况中，能够在这短时间中已经开始反应并且因此出现信号上升。在该情况下，惯例地确定凝血时间是困难的，因为对于“可辨认的纤维蛋白形成”来说(不仅关于测试和设备专用的阙值或可替换地关于与凝血反应的开始和结束相关的百分比的信号差)都必须已知初始值。
技术实现思路
因此，本专利技术的目的在于，修改用于确定人体血浆样本中的纤维蛋白原浓度的Clauss方法，从而能以高精度执行自动处理，并且能够放弃应用增强信号的附加试剂、例如陶土。该目的由此实现，即不再确定样本的迄今为止常用的凝血时间，而是测量纤维蛋白形成的反应动力学并且为了确定纤维蛋白原浓度而应用反应速度。因此，本专利技术的内容为用于根据Clauss方法确定人体血浆样本中的纤维蛋白原浓度的方法，该方法包括步骤：提供包含血浆样本和凝血酶的反应混合物，测量反应混合物关于时间的吸光值，由所测量的吸光值关于时间建立反应曲线，借助于回归法测定最大吸光变化，并且借助于校准曲线确定纤维蛋白原浓度，该校准曲线由已知的纤维蛋白原浓度与最大吸光变化的对应关系来建立。对于专业人员来说，充分已知了血浆样本和凝血酶单元的混合比例，即相对较低的纤维蛋白原浓度(来自于样本)与相对较高的凝血酶浓度的组合，其用于根据Clauss方法提供反应混合物从而使纤维蛋白形成速度实际上仅与纤维蛋白原浓度相关(参见Thomas,L.，实验和诊断，第7版，TH-Books出版社有限公司，法兰克福，2008年，16.15.2章)。优选地，反应混合物对此包含大约0.03至0.4mg/mL的纤维蛋白原和大约25至40IU/mL的凝血酶。这些浓度例如能够由此得到，即将缓冲器中的大约1:10地稀释的要试验的血浆样本与凝血酶浓度大约100IU/mL的、已缓冲的凝血酶试剂以2+1的比例混合。因此，能够确定大约0.5g/L至6.0g/L的纤维蛋白原浓度。通过改变样本的预稀释能够测量人体血浆中纤维蛋白原的总体生理学出现范围。反应混合物关于时间的吸光值的测量能够光度地、即通过测量穿过反应混合物发出的光射线的光衰减，或者浊度地、即通过测量穿过反应混合物发出的光射线的散射光分量来实现。理想地，在将凝血酶添加给样本之后立即开始测量，并且连续地执行吸光值测量直到纤维蛋白形成结束。然而实际上，在分析设备上自动化地执行时，在将凝血酶试剂添加到具有随后的混合物的反应容器中与反应容器沉淀到测量位置之间经过了较短的时间间隔(几秒钟)。已发现，根据本专利技术的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于根据Clauss方法确定血浆样本中的纤维蛋白原浓度的方法，所述方法包括以下步骤：·提供包含血浆样本和凝血酶的反应混合物，·测量所述反应混合物关于时间的吸光值，·由所测量的所述吸光值建立关于时间的反应曲线，·借助于回归法测定最大吸光变化，并且·借助于校准曲线确定纤维蛋白原浓度，所述校准曲线由已知的纤维蛋白原浓度与最大吸光变化的对应关系来建立。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.31 EP 16163255.91.一种用于根据Clauss方法确定血浆样本中的纤维蛋白原浓度的方法，所述方法包括以下步骤：·提供包含血浆样本和凝血酶的反应混合物，·测量所述反应混合物关于时间的吸光值，·由所测量的所述吸光值建立关于时间的反应曲线，·借助于回归法测定最大吸光变化，并且·借助于校准曲线确定纤维蛋白原浓度，所述校准曲线由已知的纤维蛋白原浓度与最大吸光变化的对应关系来建立。2.根据权利要求1所述的方法，其中，回归法包括以下步骤：·第一步骤，在所述第一步骤中利用预先规定的第一回归区间确定所述反应曲线中的第一初步最大吸光变化，·第二步骤，在所述第二步骤中根据确定的所述第一初步最大吸光变化并且根据预先规定的参数确定第二回归区间，和·第三步骤，在所述第三步骤中利用所述第二回归区间确定所述最大吸光变化。3.根据权利要求1所述的方法，其中，包含血浆样本和凝血酶的所述反应混合物的提供包括将凝血酶添加给血浆样本，并且其中，在将凝血酶添加给血浆样本的时间点与开始测量所述反应混合物的所述吸光值之间存在0.5至5秒、优选3至4秒的时间间隔。4.一种自动分析设备(10)，具有至少一个移液装置(21、27)、光度测量站或浊度测量站(30)和数据处理单元，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：迪尔克·格赖斯，诺贝特·桑德尔，
申请(专利权)人：西门子医学诊断产品有限责任公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE