生物样本的多路复用分析中的串扰校正制造技术

确定多路复用分析的I个荧光编码微粒集{μPi}i∈{1,2,…,I}的荧光值{i

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生物样本的多路复用分析中的串扰校正
本专利技术涉及生物多路复用分析，特别是涉及基于检测生物样本中的多个生物标志物的复杂疾病的诊断。
技术介绍
复杂疾病的诊断和治疗的响应经常与多个生物分子，而不是单个的可识别的生物标志物相关。与一次测量一个分析物的传统技术相反，多路复用技术可以在单个测定中使用相同的条件从单个生物样品中测量数十种至上千种不同的生物分子，例如蛋白质或核酸。基本地，不同类型的捕获分子，例如抗体、靶蛋白、肽或核酸，被设置于填充了样品的测定装置中，每种捕获分子被设计为与样品中待检测的生物标志物一起形成特定的荧光标记的配合物(被称为“靶向荧光标记的生物标志物”)。多路复用技术的一个主要难题在于在单次测定中确定源自单个类型的荧光标记的生物标志物与其互补的捕获分子的荧光(后文称为“单独荧光”)。现有技术存在各种多路复用技术，各技术通常通过解决上述问题的特定的编码策略来分类。市面上使用最多的可行的多路复用技术是基于阵列或基于珠的。在基于阵列的技术中，捕获分子以已知的布置连接在平板上以形成一个“捕获点”的2D阵列，各捕获点用于捕获一种特定的生物标志物。因此，这样的平面布置依靠捕获点的x-y坐标来确定各生物标志物的荧光。基于珠的技术是基于光谱编码，其中颜色和强度使得各珠群体可以区分。这些技术已经被证明有高度的灵活性和扩展性。然而，现有的可行的基于珠的系统被设计为节省成本地分批运行，并且需要等待足够的样本以填充平板，使得常规临床检验的周转时间变慢。另外，因为主要是由扩散作用驱动，该两项技术都受较慢的结合动力学的影响。即使使用搅拌加快该过程，通常这也会延长样品孵育时间。另外，由扩散限制的结合机制也会导致测定批内和批间的变化。为了解决上述限制，本申请设计了一种基于编码微粒和微流体通道的多路复用技术。例如，DidierFalconnet等人在Anal.Chem.(2015,87,1582-1589)的“用于分析蛋白质和核酸生物标志物的快速、灵敏和实时的多路复用平台”中描述了该技术，并且该文章的支持信息可以从http://pubs.acs.org下载。实施该技术的一种设备，被称为“EvaluationTM”，由比利时Ghent市的MyCartis所出售。现在结合图1，简要地描述该技术的主要组件(编码微粒，微流体通道盒和仪器设备)。参见图1A，编码微粒10，或“载体”，为盘状，直径为40μm，高度为10μm，并且由硅片制成，如使用MEMS加工技术制成。每个微粒10的边缘使用存在或不存在孔14而形成的10位二进制编码Idm12，或“标识符”，明确地进行编码。捕获分子被连接在微粒10的两面，因此后者可以作为多种可能的捕获分子的固体支持物，可能的捕获分子包括抗体、靶蛋白、肽、核酸或其他生物分子。更具体地，单个类型的捕获分子(即，用于捕获一种特定生物标志物的捕获分子)被束缚在共享同样的编码Idm的微粒上。参见图1B，盒20，或“测定盘”，具有多个能容纳编码微粒混合物的微型通道22，并且因此使得可以同时地或顺序地(即在不同的日期)运行多种样品。每个通道22由透明壁组成并且连接入口井24和出口井26，使得通道22在大气压之上增压，使得通道能够微流体操作。通道22比微粒的直径宽至少5倍，例如10倍，并且各自地包括过滤器结构以限制通道的检测区域内的微粒。通道的高度为了有效地装载和平铺微粒进行了优化。浅的通道高度防止微粒彼此重叠，因此微粒在通道内单层布置，微粒的其中一个面可以完全地用于成像目的。微粒在通道中的单层布置使得能使用高分辨率成像来解码和荧光量化。每个通道都可以装载上千的微粒，一个满装载的通道能够多路复用分析多于一百个不同的生物标志物，其中数十个微粒用于一种要被搜寻的生物标志物。为了多路复用分析的目的，装载与通道内的微粒温和无包括多个共享同样编码的微粒，以此形成能给统计置信提供测量冗余的群。仪器设备的目的在于获取通道的图像，控制通道中的流体驱动和分析获取的图像。更具体地，仪器设备包括：-光学系统28，例如具有长工作距离物镜和高灵敏度CMOS相机，用于获取盒的检测区域的亮视场和落射荧光图像(如在640nm激发，使用激光)。物镜安装于自动的x-y-z平台上，用于在实时读数的测定中或在结束点扫描每个通道；-照明系统(未示出)，用于均一地照明检测区域，以获得微粒在明亮背景中的高对比度图像，用于解码目的；-控制单元(未示出)，用于控制盒的微流体操作(入口/出口井、增压、温度等)，和光学系统的操作；-计算单元30(如个人电脑、服务器、或更通常地，任何被配置为从相机接收数据并且根据储存在处理器中的指示处理数据的计算硬件)，可能是控制单元的部分或与之独立，耦合到相机用于接收其图像，并且运行多路复用分析计算程序以自动地基于光学系统获取的荧光和亮光图像量化测试的样品中的生物标志物。参见图2，因此，由上述的多路复用技术实施的多路复用分析包括：-制造微粒的悬浮混合物32，微粒10基于测试样品中需要搜寻的生物标志物选择，并且在盒20中装载液体的微粒混合物32以填充一个或多个通道22，以提供微粒的平面布置用于优化读数的目的(图2A)；-在通道22中装载测试的液体样品，如有必要，与试剂一起装载(例如用于夹心反应)，由此在测试样品中的生物标志物34和连接在微粒10的捕获分子36之间的微流体环境中启动温育和/或结合反应(图2B)；-获取通道22的检测区域的图像(如实时或在过程结束时)。由于微粒10由于增压和过滤元件被固定在通道22中，图像获取的循环优选地在于连续地获取亮视场图像38和荧光图像40，或反之亦然，因此每个微粒的位置在这两个图像中是相同的；-对于每个通道22和通道的一组亮视场图像和荧光图像38和40：○分析亮视场图像38以识别每个微粒10在通道22中的位置Xi，并且以读取每个微粒10的编码Idm12；○分析荧光图像40以确定荧光图像中每个微粒10的荧光(例如，对应于对应微粒中心部分的图像部分的像素所拟合的核密度的最大值)；-对于每个通道22和每个通道中共享同样的编码Idm的微粒10的群：○计算群的荧光聚合值例如：在荧光应用Tukey的箱图滤波器以滤除异常荧光值然后计算聚合值作为剩余荧光值的算数平均值(图2D)；○基于聚合值使用预先确定的用于生物标记物且存储于计算单元30的数字存储器的荧光与浓度的关系(如表格、解析数学模型等)，确定测试样品(或“滴定”)中的生物标志物浓度[b](图2E)。之后，计算出的浓度被显示给用户和/或存储于数字存储器(如计算单元中的存储器)。该多路复用技术使得：(i)由于反应限制的结合机制，测定时间短，再现性高；(ii)动力控制测定条件和实时结合监测使得在单次的测定运行中优化多个参数；(iii)与每个种免疫测定形式的兼容性，例如同时合并样品和检测抗体，从而简化工作流程；(iv)基于初始结合率的分析物量化导致系统动态范围增加；(v)通过增强荧光收集的高敏感性；(vi)如有需要，也可以运行单路测定(即只提供一个类型的捕获分子用于量化地测量特定的生物标志物)。然而，在一些情况中，从多路复用测定数据计算出的生物标志物浓度[b]和从单路测定数据计算出的生物标志物浓度[b]有所区别。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是在多路复用分析中提出本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种确定多路复用分析的I个荧光编码微粒集{μPi}i∈{1,2,…,I}的荧光值

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.09.22 EP 15186210.91.一种确定多路复用分析的I个荧光编码微粒集{μPi}i∈{1,2,…,I}的荧光值的方法，所述微粒在单层布置中，所述方法包括：-获取所述荧光编码微粒集{μPi}i∈{1,2,…,I}的数字荧光图像；和-仅基于对应于所述荧光编码微粒μPi的所获取的图像的像素,为所述荧光编码微粒集{μPi}i∈{1,2,…,I}的每个荧光编码微粒μPi计算荧光值其特征在于，所述方法包括通过由串扰荧光贡献校正所述荧光编码微粒μPj的第一荧光来计算所述荧光编码微粒μPj的荧光值其中所述串扰荧光贡献被建模为来自所述荧光编码微粒集{μPj}i∈{1,2,…,I}中其他荧光编码微粒{μPj}j≠i的所述第一荧光的单独贡献的和。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，计算所述荧光值包括：-计算所述荧光编码微粒集{μPi}i∈{1,2,…,I}中的各荧光编码微粒μPi在所述数字荧光图像中的位置Xi；-将所述第一荧光建模为所有荧光编码微粒{μPi}i∈{1,2,…,I}的所述位置{Xi}i∈{1,…,I}和所述荧光值的函数；和-计算所述函数的逆以获得所述荧光值3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述荧光的计算基于以下关系执行：其中为第j个荧光编码微粒μPj的荧光，并且αij为第一荧光中第j个荧光编码微粒μPj的单一串扰荧光贡献，所述单一串扰荧光贡献αij仅取决于荧光编码微粒μPi和μPj之间的距离di,j。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括：-计算所述数字荧光图像中第i个和第j个荧光编码微粒之间的所述距离di,j；-对于所述I个的荧光编码微粒集中的每对编码微粒(μPi,μPj)，基于所述距离di,j计算所述对(μPi,μPj)的所述单一串扰荧光贡献αij；-基于以下关系，计算所述荧光编码微粒集{μPj}i∈{1,2,…,I}的所述荧光5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述第i个荧光编码微粒的第一荧光中的第j个编码微粒的所述统一串扰荧光基于以下关系计算：其中N为大于或等于2的整数，θn、kn和βn为预定的参数。6.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述荧光编码微粒集{μPi}i∈{1,2,…,I}中的每个荧光编码微粒μPi包括M个不同的独特的标识符集{idm}i∈{1,2,…,M}的标识符Idm(i)，所述标识符IdM(i)通过所述荧光编码微粒μPi的数字图像的处理而可读取，并且所述方法还包括：-获取所述荧光编码微粒集{μPi}i∈{1,2,…,I}的数字图像；-读取所述数字图像中每个编码微粒μPi的标识符Idm(i)；和-对于所述M个不同的独特的标识符集{idm}m∈{1,2,…,M}的每个标识符idm，基于所述包括所述标识符的荧光编码微粒的荧光计算聚合荧光7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述荧光编码微粒集{μPi}i∈{1,2,…,I}的每个荧光编码微粒μPi包括由荧光配合物涂覆的表面，所述荧光配合物与所述荧光编码微粒的所述标识符Idm(i)独特地相关联，所述配合物包括固定到所述编码微粒μPi的第一非荧光分子和结合到所述第一非荧光分子的第二荧光分子。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述编码微粒具有相等尺寸。9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述方法包括：-在获取所述荧光编码微粒集{μPi}i∈{1,2,…,I}的所述数字荧光图像之前：o在没有任何第二荧光分子结合到所述第一非荧光分子的情况下在通道中设置所述微粒，以便将所述微粒布置在单层中；和o用液体样品填充所述通道，-基于所述聚合荧光计算所述样品中第二荧光分子的浓度。10.一种确定I个荧光编码微粒集{μPi}i∈{1,2,…,I}的荧光的系统，包括：-至少一个通道，用于接收单层布置中的所述I个荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴维·勒贝特兹，戴维·贝尔纳斯科尼，马蒂厄·加亚尔，迪迪埃·法尔科内，若泽·吉尔，
申请(专利权)人：迈卡提斯公众有限公司，
类型：发明
国别省市：比利时,BE