AXMI554δ-内毒素基因及其使用方法技术

提供了用于赋予细菌、植物、植物细胞、组织和种子杀有害生物活性的组合物和方法。提供了包含毒素多肽的编码序列的组合物。这些编码序列可以用于在植物和细菌中用以转化和表达的DNA构建体或表达盒中。组合物还包含转化的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。具体而言，提供了分离的毒素核酸分子。此外，涵盖对应于多核苷酸的氨基酸序列，以及与那些氨基酸序列特异性结合的抗体。具体而言，本发明专利技术提供了分离的核酸分子，这些核酸分子包含编码SEQ ID NO:4‑11中所示的氨基酸序列的核苷酸序列或在SEQ ID NO:1‑3中列出的核苷酸序列，及其变体和片段。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】AXMI554δ-内毒素基因及其使用方法相关申请的交叉引用本申请要求2015年10月14日提交的美国临时申请序列号62/241/220的权益，将其内容通过引用以其全文结合在此。
本专利技术涉及分子生物学领域。提供了编码杀有害生物蛋白的新颖基因。这些蛋白质和编码它们的核酸序列在制备杀有害生物配制品中和在生产转基因抗有害生物植物中是有用的。
技术介绍
苏云金芽孢杆菌是形成孢子的革兰氏阳性土壤细菌，其特征在于其产生对某些目和种的昆虫特异地有毒但对植物和其他非靶向生物体无害的结晶内含物的能力。由于这个原因，包括苏云金芽孢杆菌菌株或它们的杀昆虫蛋白的组合物可以用作环境上可接受的杀昆虫剂以控制农业昆虫有害生物或者多种人或动物疾病的昆虫媒介。来自苏云金芽孢杆菌的晶体(Cry)蛋白(δ-内毒素)具有主要针对鳞翅目的、半翅目的、双翅目的和鞘翅目的幼虫的有效的杀昆虫活性。这些蛋白质还已经显示针对膜翅目、同翅目、虱目、食毛目和蜱螨亚纲(Acari)有害生物目，连同其他无脊椎动物目(如线形动物门、扁形动物门和肉足鞭毛亚门(Sarcomastigorphora))的活性(Feitelson(1993)TheBacillusThuringiensisfamilytree[苏云金芽孢杆菌家族树].在AdvancedEngineeredPesticides[先进的工程化杀有害生物剂],MarcelDekker,Inc.[马塞尔·德克尔公司],纽约,纽约州)。这些蛋白质最初主要基于它们的杀昆虫活性而分类为CryI至CryV。主要类别是鳞翅目特异性的(I)、鳞翅目和双翅目特异性的(II)、鞘翅目特异性的(III)、双翅目特异性的(IV)以及线虫特异性的(V)和(VI)。这些蛋白质进一步分类为亚家族；在每个家族内更高度相关的蛋白质被指定了分区字母，如Cry1A、Cry1B、Cry1C等。在每个分区内甚至更密切相关的蛋白质被给予了如Cry1C1、Cry1C2等的名称。基于氨基酸序列同源性而不是昆虫靶标特异性描述了Cry基因的命名法(Crickmore等人(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.[微生物学与分子生物学评论]62:807-813)。在此分类中，每种毒素被指定了包括第一级(primaryrank)(阿拉伯数字)、第二级(secondaryrank)(大写字母)、第三级(tertiaryrank)(小写字母)和第四级(quaternaryrank)(另一个阿拉伯数字)的唯一名称。在第一级中，罗马数字已被换成阿拉伯数字。序列一致性小于45％的蛋白质具有不同的第一级，并且第二级和第三级的标准分别为78％和95％。晶体蛋白不展示杀昆虫活性，直至其被摄取并溶解在昆虫中肠之中。被摄取的原毒素在昆虫消化道中被蛋白酶水解成活性毒性分子。(和Whiteley(1989)Microbiol.Rev.[微生物学评论]53:242-255)。此毒素与靶标幼虫的中肠中的顶端刷状缘受体结合并插入顶端膜中，产生离子通道或孔，从而导致幼虫死亡。δ-内毒素通常具有五个保守的序列结构域和三个保守的结构性结构域(参见例如，deMaagd等人(2001)TrendsGenetics[遗传学趋势]17:193-199)。第一个保守的结构性结构域由七个α螺旋组成并且参与膜插入和孔形成。结构域II由排列成希腊钥匙构型的三个β-片层组成，并且结构域III处于“果冻卷”构造的两个反向平行的β-片层组成(deMaagd等人,2001，同上)。结构域II和III参与受体识别和结合，并且因此被认为是毒素特异性的决定簇。除了δ-内毒素之外，还有几种其他已知类别的杀有害生物蛋白毒素。这些VIP1/VIP2毒素(参见例如，美国专利5,770,696)是二元杀有害生物毒素，它们通过如下机制对昆虫展示强活性，该机制被认为涉及受体介导的胞吞随后是细胞毒化，类似于其他二元(“A/B”)毒素的作用方式。A/B毒素(如VIP、C2、CDT、CST或炭疽芽孢杆菌水肿和致命毒素)最初通过“B”组分(作为单体)的特异性的受体介导的结合与靶标细胞相互作用。这些单体然后形成同七聚物(homoheptamer)。然后该“B”七聚物-受体复合物充当对接平台，随后该平台约束并允许酶的一种或多种“A”组分通过受体介导的胞吞而易位到细胞溶质中。一旦到细胞的细胞溶质内部，“A”组分通过例如G-肌动蛋白的ADP-核糖基化、或增加环状AMP(cAMP)的胞内水平而抑制正常细胞功能。参见Barth等人(2004)MicrobiolMolBiolRev[微生物学与分子生物学评论]68:373--402。大量使用基于苏云金芽孢杆菌的杀昆虫剂已经引起小菜蛾(diamondbackmoth，Plutellaxylostella)的田间种群的抗性(Ferre和VanRie(2002)Annu.Rev.Entomol.[昆虫学年评]47:501-533)。最常见的抗性机制是该毒素与其一种或多种特异性中肠受体的结合的减少。这还可以赋予针对共享相同受体的其他毒素的交叉抗性(Ferre和VanRie(2002))。由于昆虫可能带来的破坏和通过控制昆虫有害生物在产量方面的改进，持续需要发现新形式的杀有害生物毒素。
技术实现思路
提供了用于赋予细菌、植物、植物细胞、组织和种子杀有害生物活性的组合物和方法。组合物包括杀有害生物的和杀昆虫的多肽的核酸分子编码序列、包含那些核酸分子的载体和包含这些载体的宿主细胞。组合物还包括这些杀有害生物多肽序列和那些多肽的抗体。这些核苷酸序列可以用于在生物体(包括微生物和植物)中用以转化和表达的DNA构建体或表达盒中。这些核苷酸或氨基酸序列可以是已设计成在生物体(包括但不限于微生物或植物)中表达的合成序列。组合物还包括包含本专利技术的核苷酸序列的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。具体而言，提供了编码杀有害生物蛋白的分离的或重组的核酸分子。另外，涵盖与这些杀有害生物蛋白对应的氨基酸序列。具体而言，本专利技术提供了分离的或重组的核酸分子，该核酸分子包含编码SEQIDNO:4-11中所示的氨基酸序列的核苷酸序列或在SEQIDNO:1-3中列出的核苷酸序列，及其生物活性变体和片段。还涵盖与本专利技术的核苷酸序列互补的核苷酸序列、或与本专利技术的序列或其互补体杂交的核苷酸序列。进一步提供了包含本专利技术的核苷酸序列、或编码本专利技术的氨基酸序列的核苷酸序列及其生物活性变体和片段的载体、宿主细胞、植物和种子。提供了用于产生本专利技术的多肽的方法，以及用于使用那些多肽来控制或杀死鳞翅目、半翅目、鞘翅目、线虫或双翅目有害生物的方法。还包括用于检测在样品中的本专利技术的核酸和多肽的方法和试剂盒。本专利技术的组合物和方法可用于产生具有增强的有害生物抗性或耐受性的生物体。这些生物体和包含这些生物体的组合物对于农业目的是所希望的。本专利技术的组合物还可用于产生具有杀有害生物活性的改变的或改进的蛋白质、或检测在产物或生物体中的杀有害生物蛋白或核酸的存在。具体实施方式本专利技术描绘了用于调节生物体(特别是植物或植物细胞)中的有害生物抗性或耐受性的组合物和方法。“抗性”是指有害生物(例如，昆虫)一旦摄取或以其他方式接触本专利技术的多肽时就被杀死。“耐受性”是指有害生物的运动、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包含编码具有杀有害生物活性的氨基酸序列的核苷酸序列的重组核酸分子，其中所述核苷酸序列选自下组，该组由以下各项组成：a)在SEQ ID NO:1‑3的任一个中列出的核苷酸序列；b)编码包含SEQ ID NO:4‑11的任一个的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；c)编码包含与SEQ ID NO:4‑11的任一个的氨基酸序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.14 US 62/241,2201.一种包含编码具有杀有害生物活性的氨基酸序列的核苷酸序列的重组核酸分子，其中所述核苷酸序列选自下组，该组由以下各项组成：a)在SEQIDNO:1-3的任一个中列出的核苷酸序列；b)编码包含SEQIDNO:4-11的任一个的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；c)编码包含与SEQIDNO:4-11的任一个的氨基酸序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。2.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述核苷酸序列是已设计用于在植物中表达的合成序列。3.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述核苷酸序列可操作地连接至能够指导所述核苷酸序列在植物细胞中的表达的启动子。4.一种包含如权利要求1所述的重组核酸分子的载体。5.如权利要求4所述的载体，该载体还包含编码异源多肽的核酸分子。6.一种含有如权利要求1所述的重组核酸的宿主细胞。7.如权利要求6所述的宿主细胞，该宿主细胞是细菌宿主细胞。8.如权利要求6所述的宿主细胞，该宿主细胞是植物细胞。9.一种包含如权利要求8所述的宿主细胞的转基因植物。10.如权利要求9所述的转基因植物，其中所述植物选自下组，该组由以下各项组成：玉米、高粱、小麦、卷心菜、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦和油菜。11.一种包含如权利要求1所述的核酸分子的转基因种子。12.一种具有杀有害生物活性的重组多肽，该重组多肽选自下组，该组由以下各项组成：a)包含SEQIDNO:4-11的任一个的氨基酸序列的多肽；和b)包含与SEQIDNO:4-11的任一个的氨基酸序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列的多肽。13.如权利要求12所述的多肽，该多肽还包含异源氨基酸序列。14.一种包含如权利要求12所述的多肽的组合物。15.如权利要求14所述的组合物，其中所述组合物选自下组，该组由以下各项组成：粉末、粉剂、小丸、颗粒、喷雾剂、乳液、胶体和溶液。16.如权利要求14所述的组合物，其中所述组合物通过干燥、冻干、匀浆、提取、过滤、离心、沉降或浓缩细菌细胞培养物来制备。17.如权利要求14所述的组合物，该组合物包含按重量计从约1％至约99％的所述多肽。18.一种用于控制鳞翅目、半翅目、鞘翅目、线虫或双翅目有害生物种群的方法，该方法包括使所述种群与杀有害生物有效量的如权利要求12所述的多肽接触。19.一种用于杀死鳞翅目、半翅目、鞘翅目、线虫或双翅目有害生物的方法，该方法包括使所述有害生物与杀有害生物有效量的如权利要求12所述的多肽接触或...

【专利技术属性】
技术研发人员：E罗杰斯维埃拉，K桑普森，D莱赫蒂宁，P洛塞尔，D波茨，N乔古莱，
申请(专利权)人：拜耳作物科学有限合伙公司，拜耳作物科学股份公司，
类型：发明
国别省市：美国,US