在植物中木质化的降低制造技术

本发明专利技术提供了含有编码羟基肉桂酰基‑辅酶A水合酶‑裂解酶(HCHL)的序列的多核苷酸的表达盒，其与异源启动子可操作地连接。也提供了工程改造有降低木质化的植物，以及来自如此工程改造的植物的细胞、植物部分和植物组织的方法。

Reduction of lignification in plants

The present invention provides a polynucleotide expression box containing a sequence containing the encoding of the hydroxyl cinnamyl coenzyme A hydration enzyme inhibitor lyase (HCHL), which is operably connected with a heterologous promoter. It also provides methods for engineering transformation of plants that reduce lignification, as well as cells, plant parts and plant tissues derived from such engineered plants.

【技术实现步骤摘要】
在植物中木质化的降低相关申请的交叉参考本申请要求2013年7月13日提交的美国临时申请号61/507,484的优先权，其通过引用纳入本文。联邦资助的研究与开发下作出专利技术的权利声明本专利技术是在美国能源部授予的合同号DE-AC02-05CH11231下由政府资助完成。政府享有本专利技术的某些权利。专利技术背景在各种农业-工业活动中使用木质纤维素植物生物质作为可再生原料。木质素是在生物质内包壳的芳族和疏水性的支链聚合物，其在工业加工中负面影响多糖的提取和水解。工程改造木质素的单体组分提供了减少其顽固性的吸引人的潜力。本专利技术提供了在拟南芥(Arabidopsis)中开发的用于过量产生稀少木质素单体的新策略，该单体以聚合物中的端基纳入并且减少了木质素链延伸。通过在拟南芥花序梗的木质化组织中表达细菌羟基肉桂酰基-辅酶A水合酶-裂解酶(HCHL)来实现这些“木质化终止剂”的生物合成。HCHL切割羟基肉桂酰基-辅酶A木质素前体的丙素(propanoid)侧链以产生相应的羟基苯甲醛。与野生型植物相比，来自表达HCHL的植物的茎积累较高量的羟基苯甲醛和羟基苯甲酸衍生物。这些C6C1酚类的部分是从植物组织中醇-可提取的并且在温和的碱水解时从不含提取物的细胞壁中释放。与野生型植物相比，具有中等HCHL活性水平的工程改造的植物没有显示出总木质素、糖含量和生物质产率的减少。然而，通过2D-NMR表征的细胞壁揭示了在芳香区中新的分子的存在并且对从这些植物中分离的木质素的分析揭示了增加的C6C1酚类端基的量和降低的分子质量分布。另外，这些工程改造的种系显示出预处理的细胞壁生物质的糖化改善。在木质素中强化的C6C1酚类端基的引入代表了改变木质素结构和降低细胞壁对于酶促水解的顽固性的希望的策略。
技术实现思路
在第一个方面，本专利技术提供了包括编码羟基肉桂酰基-辅酶A水合酶-裂解酶(HCHL)和异源启动子的多核苷酸序列的分离的表达盒，并且该启动子与该多核苷酸序列可操作地连接。在一些实施方式中，HCHL是荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)HCHL，其具有SEQIDNO：1所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，在表达盒中使用的启动子是次生细胞壁特异性启动子，如pIRX5，其在SEQIDNO：3所示的多核苷酸序列中。在第二个方面，本专利技术提供了用于工程改造具有降低的木质化的植物的方法。所述方法包括以下步骤：(1)将本文所述的表达盒转导进入植物；以及(2)在表达HCHL的条件下培养该植物，从而减少该植物中的木质化。在一些实施方式中，植物选自拟南芥、杨树、桉树、水稻、玉米、柳枝稷、高粱、粟、芒、甘蔗、松树、苜蓿、小麦、大豆、大麦、草皮草、烟草、大麻、竹子、油菜、向日葵、柳树和短柄草。在第三个方面，本专利技术提供了通过本文所述方法工程改造的植物，来自这样的植物的植物细胞，来自这样的植物的种子、花、叶或果实，含有本文所述的表达盒的植物细胞，以及包括来自本文所述的植物或植物的部分的植物组织的生物质。因此，本专利技术提供了包括与启动子可操作地连接的异源羟基肉桂酰基-辅酶A水合酶-裂解酶(HCHL)的工程改造的植物。在一些实施方式中，编码异源HCHL的多核苷酸被整合进入植物基因组中。在一些实施方式中，启动子对于植物是异源的。在一些实施方式中，所述启动子是内源性启动子。在一些实施方式中，所述启动子是次生细胞壁特异性启动子，如IRX5启动子。在一些实施方式中，HCHL是荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)HCHL。植物可以是单子叶植物或双子叶植物。在一些实施方式中，植物选自拟南芥、杨树、桉树、水稻、玉米、柳枝稷、高粱、粟、芒、甘蔗、松树、苜蓿、小麦、大豆、大麦、草皮草、烟草、大麻、竹子、油菜、向日葵、柳树和短柄草。在其它方面，本专利技术提供了使用本专利技术的工程改造的植物、植物的部分或包括来自植物的材料的植物生物质的方法。在一些实施方式中，与未经过改性以表达HCHL的野生型植物相比，在糖化反应，例如酶促糖化中使用植物材料以增加的效率水平产生可溶的糖。在一些实施方式中，与野生型植物相比，使用该植物、植物的部分或植物生物质材料来增加生物质产率或对于木材工业(如造纸、制浆和建筑)简化下游的加工。在一些实施方式中，使用该植物、植物部分或植物生物质材料来提高用于建筑目的的木材的品质。在一些实施方式中，能够在燃烧反应、气化、热解、或多糖水解(酶促或化学)中使用该植物、植物部分或植物生物质材料。在一些实施方式中，与野生型植物相比，该植物、植物部分或植物生物质材料被用作更易于消化的饲料。附图说明图1.HCHL-介导的羟基肉桂酰基-辅酶A转化为羟基苯甲醛。HCHL进行羟基肉桂酰基-辅酶A(R＝H，香豆酰-辅酶A；R＝OH，咖啡酰-辅酶A；R＝OCH3，阿魏酰-辅酶A)的水合和切割通过相应的反应中间体4-羟基苯基-β-羟基丙酰基-辅酶A产生羟基苯甲醛(R＝H，4-羟基苯甲醛；R＝OH，3，4-二羟基苯甲醛；R＝OCH3，4-羟基-3-甲氧基苯甲醛)和乙酰辅酶A。图2.在IRX5：HCHL品系中HCHL表达的分析。(A)用分离自T1代中5个独立的5周龄转化体的次生茎(secondarystem)的mRNA通过RT-PCR检测HCHL转录物。使用由纯化自野生型(WT)茎的mRNA合成的cDNA作为阴性对照。使用Tub8-特异性引物来评价每个样品的cDNA量。(B)通过使用通用抗体和5μg的提取自在T2代中5个5周龄的IRX5：HCHL转化体的初级茎(primarystem)的总蛋白对AttB2肽(大小约32kDa)标记的HCHL的western印迹的检测。来自野生茎(WT)的蛋白提取物被用作阴性对照。图3.来自5周龄拟南芥植物的茎切片的组织化学染色。(A)染色。(B)间苯三酚-HCl染色。(C)甲苯胺蓝O染色。i，束间纤维；x，木质部。对于(A)和(B)标尺表示50μm，对于(C)表示20μm。注意品系IRX5：HCHL(4)中观察到的塌缩的木质部导管(黄色箭头)。图4.IRX5：HCHL和野生型植物的光谱分析。(A)使用FT-拉曼光谱的在来自野生型(WT)和品系IRX5：HCHL(2)的成熟衰老茎的CWR中木质素和多糖的含量。数值代表在1555-1690cm-1和1010-1178cm-1的范围内积分强度，其分别用于木质素和多糖(纤维素/半纤维素)定量。数值是3个生物重复样的平均值±SE。(B)从野生型和品系IRX5：HCHL(2)的茎基(basalstem)切片中木质部(黑线)和束间纤维(灰线)得到的FT-IR光谱的比较。对于野生型对于转基因的吸收值以及图对于波数进行斯氏t检验。在每个波长上，-2和+2之间的区域对应于两种测试的基因型之间没有显著差异(p-值＜0.05)。显著阳性的t-值表示在野生型中吸收值高于IRX5：HCHL植物。图5.品系IRX5：HCHL植物的2D-HSQCNMR谱分析。来自野生型(WT)茎(A)和来自IRX5：HCHL(FCA1)茎(B)的木质素的2D-HSQCNMR谱；差异图谱(IRX5：HCHL(2)-野生型)显示在芳香区(C)中存在新的组分。图6.纯化自野生型和品系IRX：HCHL(2)植物的茎的CEL木质素的多分散性概况。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种遗传修饰植物以表达细菌羟基肉桂酰基一辅酶A水合酶‑裂解酶(HCHL)从而获得植物的方法，与没有遗传修饰的对应野生型植物相比，所述植物包含具有降低的木质素聚合物的支化程度和木质素尺寸的木质组织，所述方法包括：(1)将包含编码细菌HCHL的核酸序列的多核苷酸导入所述植物基因组中，其中所述核酸序列与对于所述植物异源的IRX5/CES4A次生细胞壁特异性启动子可操作地连接；(2)在所述细菌HCHL表达的条件下培养所述植物；并且(3)选择与没有遗传修饰的对应野生型植物相比含有具有降低的木质素聚合物的支化程度和木质素尺寸的木质组织的植物；并且具有视觉上正常的生长和发育特征。

【技术特征摘要】
2011.07.13 US 61/507,4841.一种遗传修饰植物以表达细菌羟基肉桂酰基一辅酶A水合酶-裂解酶(HCHL)从而获得植物的方法，与没有遗传修饰的对应野生型植物相比，所述植物包含具有降低的木质素聚合物的支化程度和木质素尺寸的木质组织，所述方法包括：(1)将包含编码细菌HCHL的核酸序列的多核苷酸导入所述植物基因组中，其中所述核酸序列与对于所述植物异源的IRX5/CES4A次生细胞壁特异性启动子可操作地连接；(2)在所述细菌HCHL表达的条件下培养所述植物；并且(3)选择与没有遗传修饰的对应野生型植物相比含有具有降低的木质素聚合物的支化程度和木质素尺寸的木质组织的植物；并且具有视觉上正常的生长和发育特征。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HCHL是荧光假单胞菌HCHL。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述植物是树木。4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述植物选自杨树、桉树、松树、和柳树。5.一种得到可溶性糖的方法，所述方法包含将获自遗传修饰的植物的木质组织的生物质在糖化反应中孵育，所述遗传修饰的植物包含由所述植物基因组内存在的多核苷酸编码的细菌羟基肉桂酰基-辅酶A水合酶-裂解酶(HCHL)，其中所述多核苷酸包含与对于所述植...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·洛克，A·G·尤德斯，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：美国,US