一种丁酸梭菌高密度连续发酵的方法及丁酸梭菌微生态制剂的制备方法技术

本发明专利技术涉及微生物发酵领域，公开了一种丁酸梭菌高密度连续发酵的方法及丁酸梭菌微生态制剂的制备方法。本发明专利技术首次采用多级连续发酵，将上级发酵罐中的发酵液以每小时5～10％发酵罐体积的速度放出到下级发酵罐中，通过补加发酵培养基或补料培养基，控制各级发酵罐中的残糖浓度，直至最后一级发酵罐中的残糖在15％以下时，放出发酵液即为丁酸梭菌菌液。将丁酸梭菌菌液于载体一起真空搅拌干燥，得到丁酸梭菌微生态制剂。本发明专利技术高密度多级连续发酵的方法能够控制各级发酵罐中菌体的生长速率与菌体密度，最大限度的降低了代谢产物的累积，促进丁酸梭菌在发酵后期的进一步生长，得到的丁酸梭菌菌液菌体浓度达到10

Method for continuous high-density fermentation of Clostridium butyricum and preparation method of Clostridium butyricum microecological preparation

The invention relates to the field of microbial fermentation, and discloses a high-density continuous fermentation method of Clostridium butyricum and a preparation method of Clostridium butyricum microecological preparation. For the first time, the invention adopts multistage continuous fermentation to release the fermenting liquid in the higher fermenting tank to the lower fermentation tank at the speed of 5 to 10% fermenting tanks per hour. By adding the fermentation medium or the supplement medium, the residual sugar concentration in the fermenting tanks at all levels is controlled until the residual sugar in the final fermentation tank is below 15%. The fermentation broth is the liquid of Clostridium butyrate. Clostridium butyricum was prepared by vacuum stirring and drying to obtain Clostridium butyricum microecological preparation. The method of high density and multilevel continuous fermentation can control the growth rate and density of the bacteria in the fermenting tanks at all levels, reduce the accumulation of metabolites to the maximum, and promote the further growth of Clostridium butyrate in the late fermentation. The concentration of Clostridium butyrate bacteria is 10.

【技术实现步骤摘要】
一种丁酸梭菌高密度连续发酵的方法及丁酸梭菌微生态制剂的制备方法
本专利技术涉及微生物发酵领域，尤其涉及一种丁酸梭菌高密连续发酵的方法，还包括一种连续发酵生产高密度丁酸梭菌微生态制剂的方法。
技术介绍
丁酸梭菌，即酪酸梭菌，又名丁酸梭状芽孢杆菌，是一种广泛存在于动物或人的肠道、酸奶和土壤的厌氧革兰氏阴性菌。丁酸梭菌能形成内生芽孢，具有耐高温、耐胃酸、耐胆盐，耐部分抗生素等特性。同时，丁酸梭菌能够刺激免疫系统，提高机体免疫力，其代谢产物具有一定抗癌，促进小肠细胞自我修复与提高小肠细胞吸收功能。丁酸梭菌的诸多优点使其在临床医学和畜牧业方面广泛应用于整肠药物、保健食品、饲料添加剂、微生物肥料等，是一种较为理想的应用前景的微生态制剂。随着抗生素滥用日益严重，丁酸梭菌活菌制剂作为替代减少抗生素的使用在预防肠道疾病中具有重要意义。丁酸梭菌菌剂的活性与其数量密切相关，现阶段限制丁酸梭菌的使用推广主要是发酵密度不高。由于丁酸梭菌在生长过程中会产生大量有机酸类代谢产物，导致培养液的pH值迅速下降；当培养液的pH值降到4.5以下时，菌体的生长繁殖就会受到抑制。因此，采用传统的菌种生产工艺，菌种的数量得不到保证，且生产成本高。现有技术对丁酸梭菌的发酵均采用了分批发酵的形式，发酵周期长，同时菌体的生长容易受到代谢物积累的负反馈，抑制其生长，导致其菌体发酵密度不高。专利CN100523171C，使用石蜡隔绝空气对丁酸梭菌进行发酵，操作不便，发酵密度较低，为15-20×108cfu/ml，发酵周期为45小时。专利CN102220269B中丁酸梭菌为固体发酵，密度为4.35×109cfu/ml，发酵周期长40～55h。专利CN103710286B对丁酸梭菌为二级种子发酵，步骤繁琐，同时发酵周期为28～32小时，发酵密度最高为2×109cfu/ml。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了避免分批发酵的劣势，提供了一种丁酸梭菌的高密度连续发酵方法，最大限度的降低代谢产物的累积，减小负反馈，促进丁酸梭菌在发酵后期的进一步生长，提高丁酸梭菌的发酵密度。本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供了一种丁酸梭菌的高密度连续发酵方法，包括如下步骤：将发酵罐串联，接入发酵培养基，通入保护气体；在一级发酵罐中接种丁酸梭菌种子液进行连续发酵培养；当所述一级发酵罐中残糖浓度低于一级设定值时，以每小时5～10％发酵罐体积的速度放出发酵液到二级发酵罐中，同时一级发酵罐补充相应体积的发酵培养基，维持残糖浓度在一级设定值范围内；当二级发酵罐中装液量体积达到70～80％罐体积时，监测残糖浓度，当残糖浓度小于二级设定值时，以每小时5～10％发酵罐体积的速度释放发酵液到下一级发酵罐，同时二级发酵罐补充相应体积的补料培养基，维持残糖浓度在二级设定值范围内；按照二级发酵罐的方法依次调节下一级发酵罐的残糖浓度，当最后一级发酵罐中残糖浓度在15％以下时，放出发酵液即为丁酸梭菌菌液。优选的，所述发酵培养基包括：8～25g/L蛋白胨和/或酵母粉,30～80g/L甘蔗蜜糖、甜菜蜜糖和木质纤维素水解糖浆中的至少一种，0.1～0.2g/LMgSO4，2～4g/LK2HPO4，1～2g/LKH2PO4，1～2mg/LMnSO4。优选的，所述补料培养基包括：30～80g/L甘蔗蜜糖、甜菜蜜糖和木质纤维素水解糖浆中的至少一种。优选的，所述丁酸梭菌种子液的接种量为发酵培养基体积的3～10％。更优选的，所述丁酸梭菌种子液的制备方法包括：将丁酸梭菌孢子接种于种子培养基中，在37℃下厌氧培养12～18h，得到的培养液为丁酸梭菌种子液。进一步优选的，每升所述种子培养基包括：酵母膏2～4g，牛肉膏8～12g，蛋白胨8～12g，可溶性淀粉0.5～1.5g，葡萄糖4～6g，半胱氨酸盐酸盐0.5g，NaCl3g，NaAc3g，刃天青3mg；所述种子培养基的pH值为6.0～7.0。优选的，所述保护气体为CO2和/或N2，或体积比为1:0.2～1的CO2和H2的混合气体；所述保护气体的通气量为0.5～1.0vvm。优选的，所述一级发酵罐中的初始糖浓度为50～150g/L。优选的，所述连续发酵培养的温度为30～40℃，pH值为6.0～7.5，搅拌速率为100～200rpm。优选的，当发酵罐数量为3个时，各级发酵罐内的糖浓度为：一级设定值：90～80％残糖；二级设定值：60～45％残糖；三级设定值：15～0％残糖。优选的，当发酵罐个数为4个时，各级发酵罐内的糖浓度为：一级设定值：95％～85％残糖；二级设定值：70～55％残糖；三级设定值：40％～25％残糖；四级设定值：15％～0％残糖。优选的，当发酵罐个数为4个时，各级发酵罐内的糖浓度为：一级设定值：95％～85％残糖；二级设定值：70～55％残糖；三级设定值：40％～25％残糖；四级设定值：15％～0％残糖。优选的，当发酵罐数量为5个时，各级发酵罐内的糖浓度为：一级设定值：95％～85％残糖；二级设定值：75％～60％残糖；三级设定值：55％～40％残糖；四级设定值：35％～20％残糖；五级设定值：15％～0％。本专利技术还提供了一种连续发酵生产高密度丁酸梭菌微生态制剂的方法，包括：将上述技术方案所述方法制备得到的丁酸梭菌菌液在2～20℃的条件下静止产孢，得到产孢丁酸梭菌菌液；将所述产孢丁酸梭菌菌液与载体混合后，在40～50℃下进行真空干燥，得到丁酸梭菌微生态制剂。优选的，所述载体为蒙脱石粉和/或硅藻土，所述产孢丁酸梭菌菌液与载体的质量比为1:0.5～5。现有技术相比，本专利技术具有以下优点：本专利技术丁酸梭菌高密度连续发酵的方法，首次采用多级连续发酵，将上级发酵罐中的发酵液以每小时5～10％发酵罐体积的速度放出到下级发酵罐中，通过补加发酵培养基或补料培养基，控制各级发酵罐中的残糖浓度，直至最后一级发酵罐中的残糖在15％以下时，放出发酵液即为丁酸梭菌菌液。本专利技术提供的高密度多级连续发酵的方法能够控制各级发酵罐中菌体的生长速率与菌体密度，最大限度的降低了代谢产物的累积，减小了负反馈，促进丁酸梭菌在发酵后期的进一步生长，达到了较高的密度，得到的丁酸梭菌菌液菌体浓度达到1011cfu/ml以上。同时，由于是连续发酵，可以在末级发酵罐不断地连续获得高密密度菌液，使得发酵周期大大减小，并且避免了重复灭菌接种等繁琐操作，简化生产工艺流程。作为一种具体的实施方案，本专利技术采用甘蔗蜜糖、甜菜蜜糖或木质纤维素水解糖浆等做为碳源，减少了碳源在丁酸梭菌代谢过程中的产酸程度，促进了菌体生长。本专利技术还提供了一种连续发酵生产高密度丁酸梭菌微生态制剂的方法，将上述方法制备得到的丁酸梭菌菌液在2～20℃的条件下静止产孢，得到的产孢丁酸梭菌菌液与载体混合后，在40～50℃下进行真空干燥，得到丁酸梭菌微生态制剂。本专利技术使用常温真空干燥方法，不仅减少了能耗，降低温度对菌体的伤害，同时省去粉碎环节，保护了菌体活性。具体实施方式为了克服现有技术中分批发酵菌体浓度低的技术问题，本专利技术提供了一种丁酸梭菌高密度连续发酵的方法，包括如下步骤：将发酵罐串联，接入发酵培养基，通入保护气体；在一级发酵罐中接种丁酸梭菌种子液进行连续发酵培养；当所述一级发酵罐中残糖浓度低于一级设定值时，以每小时5～10％发酵罐体积的速度放出发酵液到二级发酵罐本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种丁酸梭菌的高密度连续发酵方法，包括如下步骤：将发酵罐串联，接入发酵培养基，通入保护气体；在一级发酵罐中接种丁酸梭菌种子液进行连续发酵培养；当所述一级发酵罐中残糖浓度低于一级设定值时，以每小时5～10％发酵罐体积的速度放出发酵液到二级发酵罐中，同时一级发酵罐补充相应体积的发酵培养基，维持残糖浓度在一级设定值范围内；当二级发酵罐中装液量体积达到70～80％罐体积时，监测残糖浓度，当残糖浓度小于二级设定值时，以每小时5～10％发酵罐体积的速度释放发酵液到三级发酵罐，同时二级发酵罐补充相应体积的补料培养基，维持残糖浓度在二级设定值范围内；按照二级发酵罐的方法依次调节下一级发酵罐的残糖浓度，当最后一级发酵罐中残糖浓度在15％以下时，放出发酵液即为丁酸梭菌菌液。

【技术特征摘要】
1.一种丁酸梭菌的高密度连续发酵方法，包括如下步骤：将发酵罐串联，接入发酵培养基，通入保护气体；在一级发酵罐中接种丁酸梭菌种子液进行连续发酵培养；当所述一级发酵罐中残糖浓度低于一级设定值时，以每小时5～10％发酵罐体积的速度放出发酵液到二级发酵罐中，同时一级发酵罐补充相应体积的发酵培养基，维持残糖浓度在一级设定值范围内；当二级发酵罐中装液量体积达到70～80％罐体积时，监测残糖浓度，当残糖浓度小于二级设定值时，以每小时5～10％发酵罐体积的速度释放发酵液到三级发酵罐，同时二级发酵罐补充相应体积的补料培养基，维持残糖浓度在二级设定值范围内；按照二级发酵罐的方法依次调节下一级发酵罐的残糖浓度，当最后一级发酵罐中残糖浓度在15％以下时，放出发酵液即为丁酸梭菌菌液。2.根据权利要求1所述的高密度连续发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基包括：8～25g/L蛋白胨和/或酵母粉,30～80g/L甘蔗蜜糖、甜菜蜜糖和木质纤维素水解糖浆中的至少一种，0.1～0.2g/LMgSO4，2～4g/LK2HPO4，1～2g/LKH2PO4，1～2mg/LMnSO4。3.根据权利要求1所述的高密度连续发酵方法，其特征在于，所述补料培养基包括：30～80g/L甘蔗蜜糖、甜菜蜜糖和木质纤维素水解糖浆中的至少一种。4.根据权利要求1所述的高密度连续发酵方法，其特征在于，所述一级发酵罐中的初始糖浓度为50～150g/L。5.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭立，敬科举，林茂，
申请(专利权)人：厦门昶科生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35