红细胞结合性治疗剂制造技术

描述了特异性结合红细胞的肽。这些以具有特异性结合红细胞的序列的肽配体，或者以提供对红细胞的特异性结合的抗体或其片段提供。所述肽可以作为与治疗剂、耐受化抗原、或靶向肽的分子融合物制备。可以通过使用融合物及选择物质上期望得到耐受性的抗原来创建免疫耐受性。与靶向肽的融合物将融合物引导至靶物，例如肿瘤，在那里红细胞结合性配体通过将红细胞募集至靶物来降低或完全消除对肿瘤的血流。

Erythrocyte binding agent

A peptide that is specific to a red cell is described. These are peptides ligands that bind specifically to the sequence of red blood cells or provide antibodies or fragments that specifically bind to red blood cells. The peptide can be prepared as a molecular fusion with therapeutic agents, tolerated antigens, or targeting peptides. Immunological tolerance can be achieved through the use of fusion material and the expected tolerance of selected substances. Fusion with the target peptide leads the fusion to the target, such as the tumor, where red cell binding ligands are raised to the target by raising red cells to the target to reduce or completely eliminate the blood flow to the tumor.

【技术实现步骤摘要】
红细胞结合性治疗剂本申请是申请日为2011年8月9日，优先权日为2010年8月10日，申请号为201180048989.8的中国专利技术专利申请“红细胞结合性治疗剂”的分案申请。对相关申请的交叉引用本申请要求2010年8月10提交的美国临时申请No.61/372,181的优先权，在此通过提及并入本文。

涉及结合红细胞的配体或抗体的医用组合物和用途。具体的用途包括免疫耐受化(immunotolerization)、药物递送、和癌症疗法。专利技术背景治疗性药物的临床成功与否可以通过其影响靶组织和器官的效力，以及其可行的递送模型来预测。最佳的药物递送平台是以最佳的作用浓度递送并维持治疗剂有效负载，并且将其递送至最佳的作用细胞靶物，同时使患者和专业看护者干预最小化的平台。专利技术概述已经发现了特异性结合红细胞(又称为红血球)的肽。这些肽配体即使在存在血液中存在的其它因子的情况下仍特异性结合红细胞。这些配体可以以多种方式使用。一个实施方案牵涉形成配体与治疗剂的分子融合物。配体结合体内的红细胞，由此治疗剂附接于红细胞并随其循环。红细胞在血流中循环很长的一段时间，在人体内约90至120天，并且它们接近许多与疾病(诸如肿瘤血管床)和生理(诸如肝和脾)有关的身体区室。可以利用这些特征使红细胞可用于治疗剂递送，例如用于+延长治疗剂在血液中的循环。此外，出乎意料地且令人惊讶地，已经发现了可以使用这些红细胞亲和配体，或近似的(comparable)抗体来产生免疫耐受。在此实施方案中，生成分子融合物，其包含致耐受性抗原和红细胞亲和配体。以足够的量注射或以其它方式施用该融合物，直至观察到耐受性。与之对照的是，先前的报告称将抗原附接于红细胞表面产生了免疫排斥。实施方案还涉及通过栓塞(embolizing)肿瘤来治疗癌症。肿瘤和/或肿瘤微血管系统的许多抗原是已知的。可以容易地生成特异性结合这些抗原的抗体。将此类肿瘤结合配体与结合红细胞的配体，即抗体(或其片段)或肽配体分子融合。这些融合物在肿瘤部位处结合，并且还结合红细胞，导致向肿瘤的血供阻断。本文中描述了这些实施方案及其它。附图简述图1是对ERY1噬菌体的红细胞结合的流式细胞术分析的散点图。图2是用可溶性生物素化ERY1肽的亲和力下拉(affinitypull-down)的照片拼合：在图2A中：使用ERY1和错配肽的洗脱样品的链霉亲合素-HRPWestern印迹；在图2B中；与红细胞全溶胞物相比使用ERY1肽的洗脱样品的抗小鼠GYPAWestern印迹。图3是细胞结合组的图。图4是ERY1-MBP的静脉内推注的半对数图，其显示了与MBP相比ERY1-MBP的静脉内施用后的血浆MBP浓度和浓度对时间。图5是ERY1-MBP的皮下推注的半对数图，其显示了皮下施用后的血浆MBP浓度；以及MBP与ERY1-MBP的浓度-时间的比较。图6是scFv工程化设计的示意图；在图6A中：从N至C端的各scFv域的线性表示；在图6B中：经折叠的scFv的构造；在图6C中：具有化学缀合的ERY1肽的经折叠scFv的构造。图6包括重复四次的接头序列GGGGS(SEQIDNO:18)。图7是柱状图的拼合，其显示了通过流式细胞术测定的结合有细菌的细胞的百分比；在图7A中，除了ERY50外，细菌表面上的肽结合红细胞，但不结合上皮293T或内皮HUVEC；在图7B中，肽结合多种人样品，但不结合小鼠血液。图8显示了ERY1和卵清蛋白(OVA)的分子融合物的实验方案和结果，其中ERY1-OVA融合物以高亲和力结合小鼠红细胞的赤道外周；图8A：ERY1肽与卵清蛋白(OVA)缀合的示意图，导致结合红细胞表面血型糖蛋白-A；小图8B：每种OVA缀合物与中间体的结合，通过流式细胞术表征；黑色实心直方图，ERY1-OVA；空心直方图，SMCC-OVA；虚线直方图，MIS-OVA；ERY1＝红细胞结合性肽WMVLPWLPGTLD(SEQIDNO:1)，MIS＝错配肽PLLTVGMDLWPW(SEQIDNO:2)，SMCC＝琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸，其用于缀合ERY1与OVA；图8C：ERY1-OVA对红细胞的平衡结合，其展示通过流式细胞术测定的ERY1-OVA的低解离常数(R2＝0.97，单一位点结合)。图9显示了缀合有ERY1的抗原的分子融合物的结合和循环的实验方案和结果：该融合物在静脉内施用后生物特异性地结合循环中的健康红细胞及红细胞凋亡的(eryptotic)红细胞，诱导被特定抗原呈递细胞亚群摄取；图9A根据流式细胞术测定的OVA(灰色实心直方图)和ERY1-OVA(黑色实心直方图)与未注射的小鼠(空心直方图)相比在体内对红细胞(CD45-)群体结合而对白细胞(CD45+)群体不结合；图9B：根据流式细胞术测定，ERY1-OVA结合而OVA不结合循环中的红细胞凋亡的(膜联蛋白-V+)红细胞和健康的(膜联蛋白-V-)红细胞；图9C：与循环红细胞结合的ERY1-OVA的细胞表面半衰期，其通过流式细胞术测量的几何均值荧光强度测定(n＝2,R2＝0.98,单相指数衰减)；图9D：通过ELISA测定，在施用剂量150μg(n＝2)下的时间依赖性ERY1-OVA细胞表面浓度。图10是若干图的拼合，显示红细胞结合不改变血液学行为；图10A血细胞比容；图10B均值血球体积，和图10C在施用10μgOVA(空心圆)或ERY1-OVA(实心圆)后的不同时间点时测得的红细胞血红蛋白含量。图11是结果的柱形图，其中缀合有ERY1的抗原生物特异性地诱导特定抗原呈递细胞亚群的摄取：图11A,与MIS-别藻蓝蛋白相比注射后12和36小时时MHCII+CD11b-CD11c+和MHCII+CD8α+CD11c+CD205+脾树突细胞(DCs)对ERY1-别藻蓝蛋白的细胞摄取增加；图11B,与MIS-别藻蓝蛋白相比在静脉内施用后36小时肝细胞(CD45-MHCII-CD1d-)和肝星形细胞(CD45-MHCII+CD1d+)，而非肝DC(CD45+CD11c+)或肝巨噬细胞(CD45+MHCII+F4/80+)对肝中的ERY1-别藻蓝蛋白细胞摄取增加。(n＝2,*P≤0.05,**P≤0.01,***P≤0.001)。数据代表均值±SE。图12是结果的拼合，其显示了ERY1-OVA分子融合物增强抗原特异性OTICD8+T细胞在体内的交叉初始化(crosspriming)和凋亡命运删除增殖(apoptotic-fatedeletionalproliferation)：图12A在静脉内施用10μgERY1-谷胱甘肽-S-转移酶(ERY1-GST,左侧小图)、10μgOVA(中间小图)、或10μgERY1-OVA(右侧小图)之后5天时经羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记的脾OTICD8+T细胞(CD3ε+CD8α+CD45.2+)的增殖；图12B来自A的OTICD8+T细胞增殖的剂量依赖性定量的增殖群体，及相同的1μg剂量给药研究，数据代表中值±最小值至最大值(n＝5,**P≤0.01,##P<0.01)；图12COTICD8+T细胞增殖世代，与OVA(中间小图)或ERY1-GST(左侧小图)相本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的肽，其包含选自下组的序列的至少5个连续的氨基酸残基：SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:1及它们的保守取代，其中所述序列特异性结合红细胞。

【技术特征摘要】
2010.08.10 US 61/372,1811.一种分离的肽，其包含选自下组的序列的至少5个连续的氨基酸残基：SEQIDNO:11,SEQIDNO:13,SEQIDNO:14,SEQIDNO:15,SEQIDNO:16,SEQIDNO:17,SEQIDNO:1及它们的保守取代，其中所述序列特异性结合红细胞。2.权利要求1的肽，其中所述序列在选自下组的序列中具有一个或多个具有D-L取代的残基或者具有至少一个且不超过两个氨基酸的保守取代：SEQIDNO:11,SEQIDNO:13,SEQIDNO:14,SEQIDNO:15,SEQIDNO:16,SEQIDNO:17,和SEQIDNO:1。3.权利要求1的肽，其基本上由选自下组的序列组成：SEQIDNO:11,SEQIDNO:13,SEQIDNO:14,SEQIDNO:15,SEQIDNO:16,SEQIDNO:17,和SEQIDNO:1。4.权利要求1的肽，其进一步还包含下述的至少一组：选自下组的序列的至少5个连续的氨基酸残基：SEQIDNO:11,SEQIDNO:13,SEQIDNO:14,SEQIDNO:15,SEQIDNO:16,SEQIDNO:17,SEQIDNO:1及它们的保守取代，其中所述序列特异性结合红细胞。5.权利要求1的肽，其残基数目为约10-约80个。6.权利要求1的肽，其进一步包含治疗剂。7.权利要求6的肽，其中所述治疗剂选自下组：胰岛素、醋酸普兰林肽(pramlintideacetate)、生长激素、胰岛素样生长因子-1、红细胞生成素、1型α干扰素、干扰素α2a、干扰素α2b、干扰素β1a、干扰素β1b、干扰素γ1b、β-葡糖脑苷脂酶、腺苷脱氨酶、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、白介素1、白介素2、白介素11、因子VIIa、因子VIII、因子IX、艾塞那肽(exenatide)、L-天冬酰胺酶、拉布立酶(rasburicase)、肿瘤坏死因子受体、和恩夫韦地(enfuvirtide)。8.权利要求1的肽，其进一步包含下组的成员：抗体、抗体片段、和单链抗原结合域(ScFv)。9.权利要求1的肽，其进一步包含致耐受性抗原。10.权利要求9的肽，其中所述致耐受性抗原选自下组：因遗传疾病缺陷的蛋白质、具有非人糖基化的蛋白质、非人蛋白质、不天然存在于人中的合成蛋白质、人食物抗原、人移植抗原、和人自身免疫抗原。11.权利要求10的肽，其包含多个特异性结合红细胞的序列。12.一种产生免疫耐受的方法，该方法包括施用包含分子融合物的组合物，所述分子融合物包含致耐受性抗原和红细胞结合性模块，该红细胞结合性模块特异性结合所述患者中的红细胞并由此连接所述抗原与所述红细胞，其中以对包含所述致耐受性抗原的物质有效产生免疫耐受的量施用所述分子融合物。13.权利要求12的方法，其中所述分子融合物由至少一个与所述抗原直接共价键合的红细胞结合性模块组成。14.权利要求12的方法，其中所述分子融合物包含至少一个附接于颗粒的红细胞结合性模块，所述颗粒附接于所述抗原或含有所述抗原。15.权利要求14的方法，其中所述颗粒选自下组：微粒、纳米颗粒、脂质体、聚合物囊泡、和胶束。16.权利要求12的方法，其中所述致耐受性抗原包含治疗性蛋白质的一部分。17.权利要求16的方法，其中所述蛋白质包括因子VIII或因子IX。18.权利要求12的方法，其中所述患者是人，且所述致耐受性抗原包含非人蛋白质的一部分。19.权利要求18的方法，其中所述蛋白质包括腺苷脱氨酶、L-天冬酰胺酶、拉布立酶、抗胸腺细胞球蛋白、L-精氨酸酶、和L-甲硫氨酸酶。20.权利要求12的方法，其中所述患者是人，且所述致耐受性抗原包含不存在于自然界的蛋白质的一部分。21.权利要求12的方法，其中所述患者是人，且所述致耐受性抗原包含含有非人糖基化的蛋白质的聚糖。22.权利要求12的方法，其中所述致耐受性抗原包含人移植抗原的至少一部分。23.权利要求12的方法，其中所述致耐受性抗原包含人自身免疫性疾病蛋白质的一部分。24.权利要求23的方法，其中所述人自身免疫性疾病蛋白质选自下组：前胰岛素原、胰岛素原、胰岛素、GAD65、GAD67、IA-2、IA-2β、甲状腺球蛋白、甲状腺过氧化物酶、促甲状腺激素受体、髓鞘碱性蛋白、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白、蛋白脂质蛋白、胶原II、胶原IV、乙酰胆碱受体、基质金属蛋白质1和3、分子伴侣热休克蛋白47、微纤维蛋白-1、PDGF受体α、PDGF受体β、和核蛋白SS-A。25.权利要求12的方法，其中所述致耐受性抗原包含人食物的一部分。26.权利要求25的方法，其中所述人食物的一部分选自下组：伴花生球蛋白(Arah1)、变应原II(Arah2)、花生凝集素(Arah6)、α-乳清蛋白(ALA)、乳转铁蛋白、谷蛋白、低分子量谷蛋白、α-和γ-麦醇溶蛋白、大麦醇溶蛋白、裸麦醇溶蛋白、和燕麦蛋白。27.权利要求12的方法，其中所述红细胞结合性模块选自下组：肽配体、抗体、抗体片段、和单链抗原结合域(ScFv)。28.权利要求27的方法，其中所述红细胞结合性模块包含scFv。29.权利要求28的方法，其中所述scFv包含10F7的轻链或10F7轻链的更高亲和力变体。30.权利要求12的方法，其中所述红细胞结合性模块包含肽配体，该肽配体包含选自下组的序列的至少5个连续的氨基酸残基：SEQIDNO:11,SEQIDNO:13,SEQIDNO:14,SEQIDNO:15,SEQIDNO:16,SEQIDNO:17,SEQIDNO:1及它们的保守取代，其中所述序列特异性结合红细胞。31.一种组合物，其包含：分子融合物，该分子融合物包含致耐受性抗原和红细胞结合性模块，所述红细胞结合性模块特异性结合所述患者中的红细胞，并且由此连接所述抗原与所述红细胞。32.权利要求31的组合物，其中所述红细胞结合性模块与所述抗原共价键合。33.权利要求31的组合物，其中所述分子融合物包含...

【专利技术属性】
技术研发人员：JA哈贝尔，S康托斯，KY戴恩，
申请(专利权)人：洛桑聚合联合学院，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH