一种检测LncRNA结合蛋白的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种检测LncRNA结合蛋白的方法，包括如下步骤：对携带有LncRNA片段模板的重组质粒进行抽提；双酶切回收得含有LncRNA模板的目的片段；经体外转录合成生物素标记的LncRNA探针；用该探针进行pull down实验，将得到的LncRNA‑蛋白复合物进行SDS‑PAGE电泳验证，即得LncRNA结合蛋白。本发明专利技术采用RNA pull down技术，通过质粒酶切大量获得LncRNA模板，再进行逆转录标记从而快速大量制备LncRNA探针，直接富集RNA结合蛋白，为分子水平的RNA和蛋白的三维结构的研究提供便利。该方法操作简单，检测结果准确、快速、自动化程度高，有较好的推广应用前景。

A method for detecting LncRNA binding protein and its application

The present invention discloses a method for detecting LncRNA binding proteins, including the following steps: extracting a recombinant plasmid carrying a template with a LncRNA fragment; recovering a target fragment containing a LncRNA template by double enzyme cutting; transcriptional synthesis of a LncRNA probe labeled with biotin in vitro; and using the probe for the pull down experiment, the obtained L will be obtained. The ncRNA binding protein complex was confirmed by SDS PAGE electrophoresis, and LncRNA binding protein was obtained. The invention uses RNA pull down technology to obtain LncRNA templates by plasmids, and then reverse transcriptase markers to quickly prepare LncRNA probes and directly enrich RNA binding proteins to facilitate the study of the three-dimensional structure of molecular level RNA and protein. The method is simple, accurate, fast and highly automated, and has good prospects for popularization and application.

【技术实现步骤摘要】
一种检测LncRNA结合蛋白的方法及其应用
本专利技术涉及分子生物学
，具体地，涉及一种检测LncRNA结合蛋白的方法及其应用。
技术介绍
长链非编码RNA(longnon-codingRNA，LncRNA)是指长度超过200个核苷酸的非编码RNA，定位于细胞核或细胞质中。与其他非编码RNA(如microRNA)相比较，LncRNA具有“三多”的特点，即类型多、作用模式多和数量多。目前，最新的非编码基因数据库列出了超过56000个人类长链非编码RNA。LncRNA主要可分为反义长链非编码RNA(antisenseLncRNA)、内含子非编码RNA(intronicLncRNA)、基因间长链非编码RNA、启动子相关长链非编码RNA(promoter-associatedLncRNA)、非翻译区相关长链非编码RNA(UTR-associatedLncRNA)等5种类型，占RNA总量的98％。然而，由于缺乏明显的开放阅读框，故LncRNA不参与蛋白质编码功能。LncRNA虽不参与蛋白质的表达，但能借助许多调控蛋白直接或间接相互作用而在表观遗传学、转录及转录后等多种层面调控基因的表达。更多的证据表明，LncRNA不仅在细胞周期、凋亡和分化等基本的细胞生物学过程中发挥调控功能，在肿瘤、癌症等疾病的发生发展过程中也发挥着重要作用。LncRNA在肿瘤生物学中发挥着重要作用，如存在LncRNALoc285194与mir-211之间、以及LncRNAGAS5和miR-21之间的“竞争性内源RNA”的调节机制；在癌症中，LncRNA的转录水平异常往往可以标志着疾病的发展程度，甚至可以用来预测个体的患病风险。由于LncRNA在肿瘤的检测及预后判断中具有潜在的应用价值，因此研究其具体作用机理十分重要。但是受研究方法所限，很多研究无法深入的了解LncRNA的相关作用机制。蛋白质与RNA的相互作用是许多细胞功能的核心，如蛋白质合成、mRNA组装、病毒复制、细胞发育调控等，了解它们之间相互作用的分子机制对理解这些生物学过程非常重要。然而，目前蛋白的检测分析方法往往受限于使用放射荧光素标记和抗原抗体结合技术，需要经过繁杂的分离纯化步骤，不仅耗时费力，也增加了实验结果的不稳定。因此迫切需要一种能快速检测LncRNA结合蛋白的方法或技术，以达到高效准确检测LncRNA结合蛋白的目的，便于研究LncRNA及其结合蛋白间的相互作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种检测LncRNA结合蛋白的方法，本专利技术采用RNApulldown技术，通过质粒酶切大量获得LncRNA模板，再进行逆转录标记从而快速大量制备LncRNA探针，可直接富集RNA结合蛋白。本专利技术的另一目的在于提供上述方法在检测肿瘤细胞LncRNA结合蛋白中的应用。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下方案予以实现的：S1.抽提含有目的LncRNA模板片段的重组质粒；S2.对重组质粒进行双酶切，回收得含有LncRNA模板的目的片段；S3.体外转录并合成生物素标记的LncRNA探针；S4.提取样本细胞的总蛋白，将LncRNA探针绑定亲和磁珠后，与总蛋白进行pulldown实验，得LncRNA-蛋白复合物；S5.将S4所得LncRNA-蛋白复合物经洗涤纯化后，进行SDS-PAGE电泳并验证，即得LncRNA结合蛋白。本专利技术采用RNApulldown技术，通过特定的LncRNA绑定目标蛋白，从而达到检测相关LncRNA结合蛋白的目的。S4中所述细胞的总蛋白为组织细胞内蛋白或微生物体外分泌蛋白。优选地，S1中所述重组质粒含有T7位点。优选地，S2中所述双酶切的反应体系包括：10μL重组质粒、5μL10×FDbuffer、2μL内切酶I、2μL内切酶II、31μLddH2O。优选地，S3中所述体外转录的反应体系包括：2μL10×buffer、6μLddH2O、7μL线性DNA模板、1μLATP、1μLCTP、1μLGTP、1μLBio-UTP、1μLT7RNA聚合酶。优选地，S4中所述亲和磁珠为链霉素磁珠。优选地，S4中所述pulldown实验的反应体系包括：5～20μL10×蛋白质-RNA结合缓冲液、0～50μL50％丙三醇、1～30μLRNA-beads、1～30μL蛋白质裂解液，加无核酶水至100μL。更优选地，S4中所述pulldown实验的反应体系包括：10μL10×蛋白质-RNA结合缓冲液、20μL50％丙三醇、30μLRNA-beads、30μL蛋白质裂解液(>2mg/mL)，加无核酶水至100μL；体系中无需加入PEG。优选地，S5中所述SDS-PAGE电泳采用非连续系统：浓缩胶5％，pH6.8，恒压80V；分离胶12％，pH8，恒压120V，循环水浴保持低温；电泳至染料距底部1cm结束。采用考马斯亮蓝染色法进行胶体考染，通过对比细胞总蛋白和经pulldown实验后LncRNA结合蛋白的凝胶图像，可得到结合的目标蛋白。优选地，所述LncRNA为反义长链非编码RNA、内含子长链非编码RNA、基因间长链非编码RNA、启动子相关长链非编码RNA或非翻译区相关长链非编码RNA。具体地，所述LncRNA为与生理功能或疾病相关的LncRNA或细胞内提取的LncRNA。作为一种优选的实施方案，所述检测LncRNA结合蛋白的方法具体包括如下步骤：1、LncRNA模板片段和pcDNA3.1载体重组质粒的扩增与抽提；2、利用内切酶I和II对重组质粒进行双酶切，回收得到含有目的LncRNA模板的线性化片段；3、体外转录并合成生物素标记的LncRNA探针；4、提取样本细胞的总蛋白，并配置蛋白裂解液，所得裂解液中蛋白浓度不小于2mg/mL，且不含有盐或洗涤剂；5、将LncRNA探针绑定亲和磁珠后，与步骤4所得总蛋白进行pulldown实验，得LncRNA-蛋白复合物；6、将步骤5所得LncRNA-蛋白复合物经洗涤纯化后，进行SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色验证，即得LncRNA结合蛋白。由于LncRNA不仅在细胞周期、凋亡和分化等基本的细胞生物学过程中发挥调控功能，在肿瘤、癌症等疾病的发生发展过程中也发挥着重要作用。在癌症中，LncRNA的转录水平异常往往可以标志着疾病的发展程度，甚至可以用来预测个体的患病风险。因此，本专利技术还请求保护上述方法在检测肿瘤细胞LncRNA结合蛋白中的应用。优选地，所述肿瘤细胞为食道癌细胞。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：(1)本专利技术采用LncRNApulldown技术，通过质粒酶切大量获得LncRNA模板，再进行逆转录标记从而快速大量制备LncRNA探针，可直接富集RNA结合蛋白，与抗体捕获相比，脱硫生物素化的目标RNA能够直接富集RNA结合蛋白，为分子水平的RNA和蛋白的三维结构的研究提供便利。(2)该方法操作简单，检测结果准确、快速、自动化程度高，有较好的推广应用前景；能够与westernblotting或质谱联用，对LncRNA结合蛋白进一步分析验证，从而为分子水平的RNA和蛋白的三维结构的研究以及相关疾病检测及干扰等提供便利。附图说明图1为本专利技术所述检测LncRNA结合蛋白的方法的流程图。图2为实施例2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测LncRNA结合蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.抽提含有目的LncRNA模板片段的重组质粒；S2.对重组质粒进行双酶切，回收得含有LncRNA模板的目的片段；S3.体外转录并合成生物素标记的LncRNA探针；S4.提取样本细胞的总蛋白，将LncRNA探针绑定亲和磁珠后，与总蛋白进行pull down实验，得LncRNA‑蛋白复合物；S5.将S4所得LncRNA‑蛋白复合物经洗涤纯化后，进行SDS‑PAGE电泳并验证，即得LncRNA结合蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种检测LncRNA结合蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.抽提含有目的LncRNA模板片段的重组质粒；S2.对重组质粒进行双酶切，回收得含有LncRNA模板的目的片段；S3.体外转录并合成生物素标记的LncRNA探针；S4.提取样本细胞的总蛋白，将LncRNA探针绑定亲和磁珠后，与总蛋白进行pulldown实验，得LncRNA-蛋白复合物；S5.将S4所得LncRNA-蛋白复合物经洗涤纯化后，进行SDS-PAGE电泳并验证，即得LncRNA结合蛋白。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1中所述重组质粒含有T7位点。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S2中所述双酶切的反应体系包括：10µL重组质粒、5µL10×FDbuffer、2µL内切酶I、2µL内切酶II、31µLddH2O。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S3中所述体外转录的反应体系包括：2µL10×b...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐梦婷，陈杰，
申请(专利权)人：广州赛哲生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44