一种葡萄糖氧化酶突变体制造技术

本发明专利技术涉及基因改造技术领域，具体提供了一种葡萄糖氧化酶突变体。所述葡萄糖氧化酶单点突变体的耐热性普遍高于野生型，60℃处理10 min后残余酶活提高了19.1‑63.8%，65℃处理5 min后残余酶活提高了27.1‑82.6%。从而说明上述单点突变导致葡萄糖氧化酶的耐热性得到大幅提升，比野生型更适合用作饲料添加剂，有利于葡萄糖氧化酶在饲料中的广泛应用，因而市场前景广阔。

A mutant of glucose oxidase

The invention relates to the field of gene transformation technology, and specifically provides a glucose oxidase mutant. The heat resistance of the glucose oxidase single point mutant was generally higher than that in the wild type. The residual enzyme activity increased by 19.1 and 63.8% after 10 min treatment at 60 C, and the residual enzyme activity increased by 27.1 82.6% after the 5 min treatment at 65. It shows that the above single point mutation leads to a large increase in the heat resistance of glucose oxidase, which is more suitable to be used as feed additive than the wild type, and is beneficial to the wide application of glucose oxidase in feed, so the market prospect is broad.

【技术实现步骤摘要】
一种葡萄糖氧化酶突变体
本专利技术属于基因改造
，具体涉及一种葡萄糖氧化酶突变体。
技术介绍
葡萄糖氧化酶是一种需氧脱氢酶，能专一地氧化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢。葡萄糖氧化酶通常与过氧化氢酶组成一个氧化还原系统，在分子氧存在下氧化β-D-葡萄糖生成D-葡萄糖酸内酯，同时消耗氧生成过氧化氢。过氧化氢酶将过氧化氢分解生成水和1/2氧，而后水又与葡萄糖酸内酯结合产生葡萄糖酸。葡萄糖氧化酶对β-D-吡喃葡萄糖表现出强烈的特异性，葡萄糖分子C1上的羟基对酶的催化活性至关重要，且羟基处于β位时要比在α位时高160倍。葡萄糖氧化酶对L-葡萄糖和2-O-甲基-D-葡萄糖完全没有活性。由于葡萄糖氧化酶的除氧和抗氧化作用，使其在食品、医药、饲料等方面应用非常广泛。在食品工业中，葡萄糖氧化酶作为一种食品保鲜剂，在防止啤酒老化、保持产品原有风味、延长保质期方面有显著效果，还可作为面粉改良剂和面包品质改良剂提高食品质量。在医药领域，我国医院普遍采用葡萄糖氧化酶电极法、葡萄糖氧化酶-过氧化物酶偶联法等检测血液、血清中葡萄糖含量。作为一种新型的饲料添加剂，葡萄糖氧化酶能够改善动物肠道环境，调节饲粮消化，促进动物生长。葡萄糖氧化酶广泛分布于动物、植物及微生物体内，工业上主要利用黑曲霉菌或青霉菌进行生产，但是常出现酶活力不高、稳定性差、杂蛋白污染以及分离纯化繁琐等问题。因为目前在颗粒生产过程中有一个短暂的80～90℃的高温阶段。而黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶热稳定性较差，其水溶液在65℃下保温5分钟剩余酶活性低于40%，使该酶在颗粒饲料的应用受到限制。目前采用饲料制粒后将葡萄糖氧化酶液体喷涂到饲料上的方法不仅增加设备投入，而且无法保证酶制剂的稳定性以及酶制剂在饲料中的分布均一性。因此，提高葡萄糖氧化酶热稳定性对目前饲料用葡萄糖氧化酶具有重要的现实意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种葡萄糖氧化酶突变体，其耐热性得到显著提高，有利于其在饲料领域的广泛应用。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种葡萄糖氧化酶突变体，其具有(Ⅰ)、(Ⅱ)或（Ⅲ）所示的氨基酸序列中任意一个：(Ⅰ)与葡萄糖氧化酶的氨基酸序列SEQIDNO:1具有至少95%同源性的序列；(Ⅱ)具有所述(Ⅰ)中所述的葡萄糖氧化酶的至少一个免疫表位，且所述葡萄糖氧化酶的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；（Ⅲ）由如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列或其互补序列或因遗传密码的简并性而与如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列或其互补序列的核苷酸序列不同的序列编码的氨基酸序列；在本专利技术的一些实施例中，所述取代为取代1个氨基酸。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代包括氨基酸序列为SEQIDNO:1的葡萄糖氧化酶的第386，387，401，406，408，418，455，466，470，476，478，479，492，493，501，531，532，546，578位氨基酸中任意一个发生了取代。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代包括第386位氨基酸由T变为A,或E,或F,或P。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代包括第387位氨基酸由T变为E,或P。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代包括第401位氨基酸由V变为F。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代包括第406位氨基酸由A变为P。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代包括第408位氨基酸由S变为A。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代包括第418位氨基酸由A变为L。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代包括第455位氨基酸由E变为D。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代包括第466位氨基酸由Q变为K。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代包括第470位氨基酸由N变为E,或F,或K。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代包括第476位氨基酸由A变为P。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代包括第478位氨基酸由Q变为K。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代包括第479位氨基酸由T变为D。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代包括第492位氨基酸由A变为P。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代包括第493位氨基酸由Y变为P。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代包括第501位氨基酸由T变为E,或K,或L,或R,或Y。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代包括第531位氨基酸由N变为F,或P。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代包括第532位氨基酸由A变为R。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代包括第546位氨基酸由G变为A。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代包括第578位氨基酸由S变为F,或K,或R,或Y。在本专利技术的一些实施例中，所述缺失为缺失1个或2个氨基酸。在本专利技术的另一些实施例中，所述缺失包括第580位氨基酸缺失。在本专利技术的另一些实施例中，所述缺失包括第579位和第580位氨基酸同时缺失。本专利技术还提供了上述葡萄糖氧化酶突变体在饲料中的应用。本专利技术还提供了具有上述DNA分子的重组表达载体。本专利技术还提供了一种宿主细胞，包含上述重组表达载体。在本专利技术的一些实施例中，宿主细胞为毕赤酵母。本专利技术提供的葡萄糖氧化酶突变体的耐热性普遍高于野生型，60℃处理10min后残余酶活提高了19.1-63.8%，65℃处理5min后残余酶活提高了27.1-82.6%。从而说明上述突变导致葡萄糖氧化酶的耐热性得到大幅提升，比野生型更适合用作饲料添加剂，有利于葡萄糖氧化酶在饲料中的广泛应用，因而市场前景广阔。具体实施方式：本专利技术用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,3ndEd.(Sambrook,2001)和CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本专利技术所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本专利技术具体实施例的限定。本专利技术中A，R，D，C，Q，E，H，I，G，N，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V分别是丙氨酸Ala，精氨酸Arg，天冬氨酸Asp，半胱氨酸Cys，谷氨酰胺Gln，谷氨酸Glu，组氨酸His，异亮氨酸Ile，甘氨酸Gly，天冬酰胺Asn，亮氨酸Leu，赖氨酸Lys，甲硫氨酸Met，苯丙氨酸Phe，脯氨酸Pro，丝氨酸Ser，苏氨酸Thr，色氨酸Trp，酪氨酸Tyr，缬氨酸Val的缩写。本专利技术具体实施例所使用的实验材料和试剂如下：菌株与载体：大肠杆菌DH5α、毕赤酵母GS115、载体pPIC9K、Amp、G418购自Invitrogen公司。酶与试剂盒：PCR酶及连接酶购买自Takara公司，限制性内切酶购自Fermentas公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自Omega公司，GeneMorphII随机诱变试剂盒购自北京博迈斯生物科技有限公司。培养基配方：大肠杆菌培养基（LB培养基）：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCl，pH7.0)；LB-AMP培养基：LB培养基加100μg/mL氨苄青霉素；酵母培养基（YPD培养基）：1%酵母提取物，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种葡萄糖氧化酶突变体，其具有(Ⅰ)、(Ⅱ)或（Ⅲ）所示的氨基酸序列中任一个：(Ⅰ) 与葡萄糖氧化酶的氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少95%同源性的序列；(Ⅱ) 具有(Ⅰ)中所述葡萄糖氧化酶的至少一个免疫表位，且所述葡萄糖氧化酶的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；（Ⅲ）由如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或其互补序列或因遗传密码的简并性而与如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或其互补序列的核苷酸序列不同的序列编码的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种葡萄糖氧化酶突变体，其具有(Ⅰ)、(Ⅱ)或（Ⅲ）所示的氨基酸序列中任一个：(Ⅰ)与葡萄糖氧化酶的氨基酸序列SEQIDNO:1具有至少95%同源性的序列；(Ⅱ)具有(Ⅰ)中所述葡萄糖氧化酶的至少一个免疫表位，且所述葡萄糖氧化酶的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；（Ⅲ）由如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列或其互补序列或因遗传密码的简并性而与如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列或其互补序列的核苷酸序列不同的序列编码的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，所述的取代为取代1个氨基酸。3.如权利要求2所述的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，所述的取代包括氨基酸序列为SEQIDNO:1的葡萄糖氧化酶的第386，387，401，406，408，418，455，466，470，476，478，479，492，493，501，531，532，546，578位氨基酸中任意一个发生了取代。4.如权利要求3所述的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，所述的取代包括T38...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴秀秀，邵弨，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37