一种从微藻中提取防污活性物质的方法技术

本发明专利技术提供了一种从微藻中提取防污活性物质的方法，包括冻融破壁、重悬浮、分级盐析、双水相萃取、超滤纯化和产品配制。本发明专利技术方法制备步骤简单、重现性好、制备成本低廉，提取防污活性物质的提取率高。最终制备得到的成品涂覆于基底上后快速成膜，形成的保护膜具有优异的憎水性能。可有效抑制蛋白磷酸酶的活性，使蛋白质发生过度磷酸化，导致细胞破裂，有效地防止海藻、浮游生物及贝类等生物在基底上附着。

A method for extracting antifouling active substances from microalgae

The invention provides a method for extracting antifouling active substances from microalgae, including freeze-thaw wall breaking, heavy suspension, fractionation salting, aqueous two-phase extraction, ultrafiltration purification and product preparation. The method has the advantages of simple preparation process, good reproducibility, low preparation cost, and high extraction rate for extracting antifouling active substances. Finally, the finished product is coated on the substrate and then quickly film-forming. The protective film formed has excellent hydrophobicity. It can effectively inhibit the activity of protein phosphatase, cause protein excessive phosphorylation, cause cell rupture, effectively prevent algae, plankton and shellfish and other organisms on the substrate.

【技术实现步骤摘要】
一种从微藻中提取防污活性物质的方法
本专利技术涉及生物活性物质提取领域，具体是一种从微藻中提取防污活性物质的方法。
技术介绍
水体富营养化程度的加剧和范围的扩大，致使淡水微藻水华爆发日趋普遍，严重破坏水体及周围环境，为消除微藻污染，每年大量的微藻被打捞上来，与此同时打捞上来的微藻的资源化利用已成为微藻重点研究课题。海洋中有2000多种污损生物，多数生活在海岸和海湾等近海海域。污损生物的幼虫和孢子能够漂浮游动，发展到一定阶段后就附着定居下来，污损海上设施，例如船体、浮标、桥墩、码头、网箱及网具等，其主要危害包括增加船舶的阻力、阻塞管道、加速金属腐蚀、使仪表及转动机失灵、对声学仪器的影响以及对水产业的影响等，由生物污损所造成的损失难以估算。海洋防污技术是用于防止海洋生物对海上设施的附着污损，起步于舰船防污涂料的研究，并以毒料释放型防污为主要技术途径，通过涂料中可释放的铜、锡、汞、铅等防污剂，在材料周围形成对海洋植物孢子以及海洋动物幼虫有毒杀作用的毒料浓度层，从而达到防污效果。然而，此类防污涂料在使用过程中，部分毒剂(如有机锡、DDT)会造成海水水体污染，引发生物变异，危及海洋食物链，对海洋生态平衡以及人类健康具有潜在的危害。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种制备方法简单、重现性好、制备成本低廉、提取率高的一种从微藻中提取防污活性物质的方法，提取得到的防污活性物质成膜后憎水性好，对污损生物的幼虫和孢子毒害效果好并可自然降解。本专利技术针对
技术介绍
中提到的问题，采取的技术方案为：一种从微藻中提取防污活性物质的方法，包括冻融破壁、重悬浮、分级盐析、双水相萃取、超滤纯化和产品配制。产品配制为在超滤纯化后得到的10份防污活性物质中加入5~10份甘油、0.001~0.002份EDTA、0.0005~0.001份DTT和0.3~0.5份间苯二酚而缩水甘油醚，混合均匀得到成品。本专利技术方法制备步骤简单、重现性好、制备成本低廉，提取防污活性物质的提取率高。最终制备得到的成品涂覆于基底上后快速成膜，形成的保护膜与水分子之间的静电引力、氢键和范德华力较小，保护膜表现出较强的憎水性。保护膜表面能低，保护膜的水接触角（WCA）为170°~185°，滚动角（SA）为0.4°~5°，具有优异的憎水性能。可有效抑制蛋白磷酸酶的活性，使蛋白质发生过度磷酸化，导致细胞破裂，有效地防止海藻、浮游生物及贝类等生物在基底上附着；间苯二酚而缩水甘油醚与甘油、EDTA和DTT有耦合作用，能够起到调节防污活性物质稳定性的作用，可以调和各组分的活性与各向异性，增加保护膜的均匀性与致密性，使保护膜在长期的使用后不会起皮、脱落，延长基底的使用寿命，降低成本。冻融破壁为：在微藻泥中加入超纯水，微藻泥和超纯水的质量体积比为1g：0.6~2.0ml，于-25~-15℃温度下冷冻，于15~25℃温度下解冻，反复冻融次数1~3次，冻融结束后2~6℃温度下8000~12000r/min离心6~15min，保存上清液。冻融破壁的方法其条件比较温和，不易造成蛋白质变性，它利用冷冻条件下细胞内形成的冰粒以及细胞液的盐浓度增高而引起的溶胀从而使细胞破碎蛋白溶出。上述冻融操作为最优选，冻融温度的改变或冻融次数的改变均会对防污活性物质活性或提取率产生不良影响。重悬浮为：在冻融破壁后得到的沉淀中加入3~6倍体积的Tris-HCl缓冲液，重复离心2~4次，合并上清液；所述Tris-HCl缓冲液pH为7.5~8.0。冻融破壁后得到的沉淀中仍存在一部分的防污活性物质，采用上述重悬浮操作，可提高防污活性物质的提取率，减少损失。分级盐析为：将冻融破壁后得到的上清液和重悬浮后得到的上清液合并，加入硫酸铵，使溶液中硫酸铵饱和度达到15~25%，搅拌，2~6℃温度下4000~6000r/min离心3~8min，取沉淀，在沉淀中加超纯水溶解加入硫酸铵使溶液中硫酸铵饱和度达到30~40%，搅拌，2~6℃温度下4000~6000r/min离心3~8min，取上清液。硫酸铵分子可快速破坏防污活性物质周围的水化层，降低其在水中的溶解度，纯化防污活性物质。双水相萃取为：在分级盐析得到上清液中加入PEG4000和磷酸钾盐KHP，调节体系pH为5.5~6.5，PEG4000浓度为12~20%,KHP浓度为10~15%，400~800r/min搅拌，转移至分液漏斗中分层，取下相，得到防污活性物质溶液。当体系pH为5.5~6.5时，防污活性物质分子表面所带的电荷被中和(或非常少)，此时净电荷的影响可以忽略不计，影响防污活性物质分配的主要是其表面性质，防污活性物质富集于聚乙二醇相中而其他杂质则分配到无机盐相中。超滤纯化为：将双水相萃取得到的防污活性物质溶液转移到超滤离心管中，2~6℃温度下8000~12000r/min离心8~15min，得到防污活性物质；所述超滤离心管规格为20~40KDa。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术方法制备步骤简单、重现性好、制备成本低廉，提取防污活性物质的提取率高。最终制备得到的成品涂覆于基底上后快速成膜，形成的保护膜具有优异的憎水性能。可有效抑制蛋白磷酸酶的活性，使蛋白质发生过度磷酸化，导致细胞破裂，有效地防止海藻、浮游生物及贝类等生物在基底上附着；间苯二酚而缩水甘油醚与甘油、EDTA和DTT有耦合作用，能够起到调节防污活性物质稳定性的作用，可以调和各组分的活性与各向异性，增加保护膜的均匀性与致密性，使保护膜在长期的使用后不会起皮、脱落，延长基底的使用寿命，降低成本。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术方案作进一步说明：实施例1：一种从微藻中提取防污活性物质的方法，包括以下步骤：1）冻融破壁：在微藻泥中加入超纯水，微藻泥和超纯水的质量体积比为1g：1ml，于-20℃温度下冷冻，于20℃温度下解冻，反复冻融次数2次，冻融结束后4℃温度下10000r/min离心10min，保存上清液；2）重悬浮：在冻融破壁后得到的沉淀中加入5倍体积的Tris-HCl缓冲液，重复离心3次，合并上清液；Tris-HCl缓冲液pH为7.8；3）分级盐析：将冻融破壁后得到的上清液和重悬浮后得到的上清液合并，加入硫酸铵，使溶液中硫酸铵饱和度达到20%，搅拌，4℃温度下5000r/min离心5min，取沉淀，在沉淀中加超纯水溶解加入硫酸铵使溶液中硫酸铵饱和度达到35%，搅拌，4℃温度下5000r/min离心5min，取上清液；4）双水相萃取：在分级盐析得到上清液中加入PEG4000和磷酸钾盐KHP（KH2PO4：K2HPO4=1:1），调节体系pH为6.0，PEG4000浓度为16%，KHP浓度为12%，600r/min搅拌，转移至分液漏斗中分层，取下相，得到防污活性物质溶液；5）超滤纯化：将双水相萃取得到的防污活性物质溶液转移到超滤离心管中，,4℃温度下10000r/min离心10min，得到粗制防污活性物质；所述超滤离心管规格为30KDa；6）产品配制：在超滤纯化后得到的10份防污活性物质中加入8份甘油、0.001份EDTA、0.0005份DTT和0.4份间苯二酚而缩水甘油醚，混合均匀得到成品。实施例2：一种从微藻中提取防污活性物质的方法，包括以下步骤：1）冻融破壁：在微藻泥中加入超纯水，微藻泥和超纯水的质本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从微藻中提取防污活性物质的方法，包括冻融破壁、重悬浮、分级盐析、双水相萃取、超滤纯化和产品配制，其特征在于：所述的产品配制为在超滤纯化后得到的10份防污活性物质中加入5~10份甘油、0.001~0.002份EDTA、0.0005~0.001份DTT和0.3~0.5份间苯二酚而缩水甘油醚，混合均匀得到成品。

【技术特征摘要】
1.一种从微藻中提取防污活性物质的方法，包括冻融破壁、重悬浮、分级盐析、双水相萃取、超滤纯化和产品配制，其特征在于：所述的产品配制为在超滤纯化后得到的10份防污活性物质中加入5~10份甘油、0.001~0.002份EDTA、0.0005~0.001份DTT和0.3~0.5份间苯二酚而缩水甘油醚，混合均匀得到成品。2.根据权利要求1所述的一种从微藻中提取防污活性物质的方法，其特征在于：所述的冻融破壁为：在微藻泥中加入超纯水，微藻泥和超纯水的质量体积比为1g：0.6~2.0ml，于-25~-15℃温度下冷冻，于15~25℃温度下解冻，反复冻融次数1~3次，冻融结束后2~6℃温度下8000~12000r/min离心6~15min，保存上清液和沉淀。3.根据权利要求1所述的一种从微藻中提取防污活性物质的方法，其特征在于：所述的重悬浮为：在冻融破壁后得到的沉淀中加入3~6倍体积的Tris-HCl缓冲液，重复离心2~4次，合并上清液；所述Tris-HCl缓冲液pH为7.5~8.0。4.根据权利要求1所述的一种从微藻中提取防污活性物质的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：李健，
申请(专利权)人：兰溪市哥特生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33