低分子量肝素制造技术

本发明专利技术涉及用于治疗和/或预防肝纤维化的低分子量肝素。所述低分子量肝素的数均分子量(Mn)的范围为2800～5000Da，重均分子量(Mw)的范围为6100～13000Da，优选其数均分子量(Mn)的范围为3000～4500Da，重均分子量(Mw)的范围为6200～12000Da，进一步优选其数均分子量(Mn)的范围为3200～4400Da，重均分子量(Mw)的范围为6300～11000Da，再进一步优选其数均分子量(Mn)的范围为3250～4200Da，重均分子量(Mw)的范围为6400～10500Da。

Low molecular weight heparin

The present invention relates to low molecular weight heparin for the treatment and / or prevention of liver fibrosis. The range of the number average molecular weight (Mn) of the low molecular weight heparin is 2800 ~ 5000Da, and the range of the weight average molecular weight (Mw) is 6100 ~ 13000Da. The range of the number average molecular weight (Mn) is from 3000 to 4500Da, and the range of the weight average molecular weight (Mw) is 6200 ~ 12000Da, and the range of its number average molecular weight (Mn) is 3200 ~ 4400Da, and the weight is equal. The range of molecular weight (Mw) is 6300 ~ 11000Da, and the range of number average molecular weight (Mn) is 3250 ~ 4200Da, and the range of heavy average molecular weight (Mw) is 6400 ~ 10500Da.

【技术实现步骤摘要】
低分子量肝素
本专利技术涉及一种新低分子量肝素以及其用于制备预防或治疗肝纤维化的药物的用途。
技术介绍
纤维化疾病是组织在受到持续性的损伤后，因为非正常的、过度修复造成富含胶原蛋白的细胞外基质(ECM)沉积在组织及器官中，使实质细胞丧失原有的功能。纤维化疾病包括累及多系统的疾病，如系统性硬化症、多灶性纤维化、硬皮病、肾源性的多系统纤维化。也包括器官组织特异性疾病，如肺、肝脏、肾脏纤维化等疾病。因为不同的纤维化病变涉及的器官及组织不同，暴露于不同的环境因素，并且组成的细胞类型不同，但纤维化过程均具有类似的病理过程：上皮细胞发生持续性损伤，分泌过量的细胞因子和生长因子。这些因子进一步刺激间充质细胞前体的招募和激活，形成肌成纤维细胞，随后分泌大量的细胞外基质。在正常的生理条件下，组织经过修复后，纤维化基质将被降解，成纤维细胞将发生凋亡，或逆转成为非活性细胞。但在纤维化疾病条件下，正常的清理及逆转化程序被破坏，实质细胞逐渐被肌成纤维细胞取代，失去了正常功能，导致了纤维化疾病的发生。在西方世界，纤维化类疾病最终为死亡率贡献了高达45％的百分率，在发展中国家尚缺乏统计数据。尽管纤维化疾病发病者众多，但对于涉及到的分子机制研究是初步的，更缺乏有效的治疗方法。肝纤维化是指肝脏内弥漫性细胞外基质(特别是胶原物质)过度沉积，是机体对各种病因引起的慢性肝损伤后的一种损伤修复反应，是肝硬化的早期可逆阶段，如不及时治疗则可能进展成为失代偿期肝硬化并出现各种终末期肝病并发症。众所周知，我国是肝病大国。我国卫生部在2006年全国人群乙肝等有关疾病血清流行病学调查结果显示，我国人群乙肝表面抗原携带率为7.18％，据此推算，大概有9300万的乙肝感染者。根据卫生部数据统计，2004～2012年我国上报病毒性肝炎发病，病例13501863例,年均发病例数为1500207例。肝纤维化是慢性病毒性肝炎向肝硬化转变的中间环节，对其进行早期干预可有效防治肝硬化的发生。
技术实现思路
肝素是一类硫酸化、多分散、线性的糖胺聚糖(Glycosaminoglycans，GAGs)，是最重要的抗凝药物之一。在临床上广泛应用于防治血栓栓塞性疾病。此外，肝素及其衍生物具有广泛的生物学活性，包括协调细胞黏附、调控细胞生长和增殖、发育过程、细胞表面结合脂蛋白脂肪酶和其它蛋白质、新血管发生、病毒入侵和肿瘤转移等等。肝素是多靶点药物，除具有抗凝血的活性外，还具备与多种生长因子，趋化因子相互结合的能力，抑制炎症细胞的招募，以及趋化因子与其受体相互作用，协调炎症细胞的黏附、组织浸润等作用。肝素具有直接与TGF-β或CTGF等纤维化活化因子结合的能力，直接抑制纤维化的进程。根据在美国肝病研究协会(AASLD)年会上展示的一项意大利小型研究的结果，采用β-降解方式，即，经成盐、酯化、碱水解工艺得到的依诺肝素(Enoxaparin)治疗对肝功能失代偿症状具有预防作用(参见VillaE,CammàC,MariettaM,etal.Enoxaparinpreventsportalveinthrombosisandliverdecompensationinpatientswithadvancedcirrhosis[J].Gastroenterology,2012,143(5):1253-1260.e4.)。在另一个临床实验中，将依诺肝素作为慢性乙肝的辅助治疗手段，血清透明质酸和IV型胶原蛋白水平经治疗后显著下降，胶原增生也同时减少，肝功能得到恢复(参见ShiJ,HaoJH,RenWH,etal.EffectsofheparinonliverfibrosisinpatientswithchronichepatitisB[J].Worldjournalofgastroenterology:WJG,2003,9(7):1611-1614.)。在动物实验水平，依诺肝素可以减轻硫己酰胺所致的大鼠肝纤维化(36％)，同时促进肝细胞的再生能力，减轻纤维化的其他症状(参见AssyN,HusseinO,KhalilA,etal.Thebeneficialeffectofaspirinandenoxaparinonfibrosisprogressionandregenerativeactivityinaratmodelofcirrhosis[J].Digestivediseasesandsciences,2007,52(5):1187-1193)。以BDL结扎的动物模型比较测定几种市场上常见的肝素例如Nadroparin、Tinzaparin、依诺肝素的抗肝纤维化活性，Nadroparin与依诺肝素均能有效降低血清碱性磷酸酶和γ-谷氨酰酶的水平，降低肝坏死面积，及纤维化面积。在CCl4引发的肝纤维化动物模型中，依诺肝素可以抑制肝细胞的凋亡及肝组织坏死(参见KuknerA,ToreF,FiratT,etal.ThepreventiveeffectoflowmolecularweightheparinonCCL4-inducednecrosisandapoptosisinratliver[J].Annalsofhepatology,2009,9(4):445-454)。另外，还有研究报道Fraxiparin-pluronicF127共聚物可以抑制肝纤维化的形成(参见LeeJH,LeeH,JoungYK,etal.Theuseoflowmolecularweightheparin–pluronicnanogelstoimpedeliverfibrosisbyinhibitiontheTGF-β/Smadsignalingpathway[J].Biomaterials,2011,32(5):1438-1445)。对于经多种降解方法得到的低分子量肝素(lowmolecularweightheparins，LMWH)干预纤维化类疾病的作用，目前也已经多有报道。但由于不同的降解方法识别肝素的序列位点不同，对纤维化疾病的干预作用效果也截然不同。因此，对于治疗纤维化类疾病的LMWH类药物，需要系统性筛选其活性，并进行构效关系研究，才能得到治疗疾病的有效组分，从而提高分子对各类疾病治疗选择性，达到结构功能的最佳匹配状态。本专利技术的专利技术人致力于肝素产业技术的创新研究，利用麦芽糖结合蛋白(MaltoseBindingProtein，MBP)融合表达技术，实现了系列肝素酶的高活性、可溶性表达和工业化生产，系列肝素酶被列为中国药典标准酶(Heparinase，分别为MBP-HepI(以下也简称为肝素酶I)、MBP-HepII(以下也简称为肝素酶II)、MBP-HepIII(以下也简称为肝素酶III)，可以分别参见中国专利ZL200410038098.6、ZL201010259905.2，以及ZL201010259913.7)。并初步建立了组合酶法制备LMWH的新工艺(参见中国专利ZL201210328649.7)。在此基础上，本专利技术人经过深入地研究，成功获得了本专利技术的新型低分子量肝素，并发现本专利技术的低分子量肝素具有预防或治疗肝纤维化的功能。本专利技术涉及以下内容：1.一种低分子量肝素，其数均分子量(Mn)的范围为2800～500本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种低分子量肝素，其数均分子量(Mn)的范围为2800～5000Da，重均分子量(Mw)的范围为6100～13000Da，优选其数均分子量(Mn)的范围为3000～4500Da，重均分子量(Mw)的范围为6200～12000Da，进一步优选其数均分子量(Mn)的范围为3200～4400Da，重均分子量(Mw)的范围为6300～11000Da，再进一步优选其数均分子量(Mn)的范围为3250～4200Da，重均分子量(Mw)的范围为6400～10500Da。

【技术特征摘要】
2016.11.29 CN 20161107851631.一种低分子量肝素，其数均分子量(Mn)的范围为2800～5000Da，重均分子量(Mw)的范围为6100～13000Da，优选其数均分子量(Mn)的范围为3000～4500Da，重均分子量(Mw)的范围为6200～12000Da，进一步优选其数均分子量(Mn)的范围为3200～4400Da，重均分子量(Mw)的范围为6300～11000Da，再进一步优选其数均分子量(Mn)的范围为3250～4200Da，重均分子量(Mw)的范围为6400～10500Da。2.根据权利要求1所述的低分子量肝素，其重均分子量的分子量分布为：分子量小于3000Da的肝素占该低分子量肝素全部的30wt％以下，优选在25wt％以下，分子量大于8000Da的肝素占该低分子量肝素全部的20wt％以上，优选在25wt％以上。3.根据权利要求1或2所述的低分子量肝素，其中，其重均分子量的分子量分布为：分子量在5000～8000Da的肝素占该低分子量肝素全部的10wt％以上，优选在15wt％以上，且在30wt％以下，优选在27wt％以下。4.根据权利要求1～3中任一项所述的低分子量肝素，其中，其重均分子量的分子量分布为：分子量在3000～5000Da的肝素占该低分子量肝素全部的25wt％以下，优选20wt％以...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏楠，闫轶姝，毕鲜荣，
申请(专利权)人：北京碧澄生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11