抗癌融合多肽制造技术

本公开内容提供了对CD137和GPC3两者特异的融合多肽，所述融合多肽可用于将CD137聚集和活化导向至GPC3阳性肿瘤细胞。这种融合多肽可用于许多制药应用中，例如用作用于治疗或预防人类疾病如各种肿瘤的抗癌剂和/或免疫调节剂。本公开内容还涉及制备本文所述的融合多肽的方法以及包含这种融合多肽的组合物。本公开内容还涉及编码这种融合多肽的核酸分子以及用于产生这种融合多肽和核酸分子的方法。此外，本申请公开了这种融合多肽以及包含一种或多种这种融合多肽的组合物的治疗和/或诊断用途。

Anticancer fusion peptide

The present disclosure provides a specific fusion peptide for both CD137 and GPC3, which can be used to direct CD137 aggregation and activation to GPC3 positive tumor cells. The fusion peptide can be used in many pharmaceutical applications, such as anticancer agents and / or immunomodulators for the treatment or prevention of human diseases, such as various tumors. The disclosure also relates to a method for preparing the fusion polypeptide described herein and a composition containing the fusion polypeptide. The disclosure also relates to nucleic acid molecules encoding such fusion peptides and methods for producing such fusion peptides and nucleic acid molecules. In addition, the present disclosure discloses the therapeutic and / or diagnostic use of the fusion polypeptide and the composition comprising one or more of these fusion polypeptides.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抗癌融合多肽
技术介绍
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)是属于糖基-磷脂酰肌醇-锚定硫酸肝素蛋白聚糖的磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族的癌胚抗原。在发育过程中，GPC3在胎肝和胎盘中表达，并在正常成人组织中下调或沉默。GPC3基因中的突变和缺失负责人的辛普森-戈拉比-贝默尔或辛普森畸形综合征。GPC3在各种癌症，特别是肝细胞癌(“HCC”)、黑素瘤、Merkel细胞癌、WiIm肿瘤和肝母细胞瘤中表达(He，H.等人AppliedImmunohistochemMolMorphol.17：40-6(2009)；Jakubovic和Jothy；Ex.MoI.Path.82：184-189(2007)；Nakatsura和Nishimura，Biodrugs19(2)：71-77(2005))。HCC是全球癌症相关死亡的第三大原因。每年由于HCC约有100万人死亡。(Nakatsura和Nishimura，Biodrugs19(2)：71-77(2005))。针对GPC3表达的癌症诸如HCC的有效治疗需要靶向GPC3并且还产生抗肿瘤作用的治疗化合物。CD137是共刺激免疫受体，是肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员。它主要在活化的CD4+和CD8+T细胞、活化的B细胞以及天然杀伤(NK)细胞上表达，但也可以被发现于静息的单核细胞和树突状细胞(Li，S.Y.等人，ClinPharmacol，20135(Suppl1)：47-53)或内皮细胞上(Snell，L.M.等人，ImmunolRev2011Nov；244(1)：197-217)。CD137在调节免疫应答中起重要作用，因此是癌症免疫治疗的靶标。CD137配体(CD137L)是唯一已知的CD137天然配体，并在APC的几种类型如活化的B细胞、单核细胞和脾脏树突状细胞上组成型表达，还可在T淋巴细胞上被诱导。CD137L是以膜结合形式和可溶性变体存在的三聚体蛋白。但是，可溶性CD137L在例如CD137表达淋巴细胞上活化CD137的能力有限，并且需要大的浓度以引发作用(Wyzgol，A.等人，JImmunol2009Aug1；183(3)：1851-1861)。CD137活化的自然途径通过CD137阳性细胞与CD137L阳性细胞的接合。认为然后CD137活化是通过经由相对细胞上CD137L的聚集来诱导的，从而导致经由TRAF1、2和3的信号传导(Snell，L.M.等人，ImmunolRev2011Nov；244(1)：197-217；Yao，S.等人，NatRevDrugDisc2013Feb；12(2)：130-146)以及在CD137阳性T细胞中进一步伴随的下游效应。在通过识别它们各自的同源靶标而活化T细胞的情况下，通过CD137的共刺激引发的效果为进一步的活化增强、生存和增殖的增强、产生促炎细胞因子以及杀死能力的提高。已经在许多临床前的体内模型中证实了CD137共刺激用于消除癌细胞的益处。例如，CD137L在肿瘤上的强制表达导致肿瘤排斥(Melero，I.等人，EurJImmunol1998Mar：28(3)：1116-1121)。同样，抗CD137scFv在肿瘤上的强制表达引起CD4+T细胞和NK细胞依赖性肿瘤消除(Ye，Z.等人，NatMed20024：8(4)：343-348；Zhang，H.等人，MolCancTher2006Jan：5(1)：149-155；Yang，Y.等人，CancRes2007Mar1：67(5)：2339-2344)。还证实了全身施用的抗CD137抗体引起肿瘤生长迟延(Martinet，O.等人，GeneTher2002Jun：9(12)：786-792)。已经表明CD137是人肿瘤中天然存在的肿瘤反应性T细胞的优良标记物(Ye，Q.等人，ClinCancRes：2014Jan1：20(1)：44-55)，可在过继性T细胞疗法的应用中使用抗CD137抗体来改善CD8+黑素瘤肿瘤浸润淋巴细胞的扩增和活性(Chacon，J.A.等人，PloSOne20138(4)：e60031)。CD137共刺激的潜在治疗好处的临床前示范促进了靶向CD137、BMS-663513(Jure-Kunkel，M.等人，美国专利7288638)和PF-05082566(Fisher，T.S.等人，CancImmunolImmunother2012Oct：61(10)：1721-1733)的治疗性抗体的开发；目前两者都处于早期的临床试验中。然而，仅近来已发现如抗体这样的二价CD137结合剂本身可能不足以将CD137聚集在T细胞或NK细胞上并导致有效的活化，类似于三价可溶性CD137L缺乏活性。在最近利用临床前的小鼠模型的出版物中，已经提供了体内证据，即其他抗TNFR抗体的作用模式实际上需要抗体通过它们的Fc部分与Fc-γ受体表达细胞上的Fc-γ受体的相互作用(Bulliard，Y.等人，JExpMed2013Aug26：210(9)：1685-1693；Bulliard，Y.等人，ImmunolCellBiol2014Jul：92(6)：475-480)。因此，目前临床开发中抗体的作用模式可以通过经由Fc-γ受体的非靶向聚集来主导，其几乎可随机地依赖于肿瘤附近Fc表达细胞的存在。因此，以特异性肿瘤靶向作用模式聚集和活化CD137的疗法的产生尚未满足需求。为了满足这种未满足的需求，本申请提供了一种通过具有以下特性的融合多肽同时接合CD137和肿瘤抗原GPC3的新方法：(a)对CD137的结合特异性；以及(b)对GPC3的结合特异性；该融合多肽被设计为通过肿瘤细胞上表达的GPC3来提供淋巴细胞上CD137的肿瘤靶标依赖性活化。预期这样的分子进一步活化位于GPC3阳性肿瘤附近的T细胞和/或NK细胞。这样的双特异性物可以显示出比抗GPC3或抗CD137抗体改进的治疗效果。定义以下列表定义了贯穿于本说明书所使用的术语、短语和缩写。本文列出和定义的所有术语旨在涵盖所有的语法形式。如本文所使用，除非另有说明，“CD137”是指人CD137以及包括人Cd137的变体、同种型和物种同系物。CD137也被称为“4-1BB”或“肿瘤坏死因子受体超家族成员9(TNFRSF9)”或“由淋巴细胞活化诱导的(ILA)”)。人CD137是指由UniProtQ07011定义的全长蛋白质、其片段或其变体。如本文所使用，除非另有说明，“GPC3”是指人GPC3以及包括人GPC3的变体、同种型和物种同系物。GPC3也被称为“磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3)”、“磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypicanproteoglycan3)”、“GPC3”、“OTTHUMP00000062492”、“GTR2-2”、“SGB”、“DGSX”、“SDYS”、“SGBS”、“OCI-5”、“SGBS1”，可互换使用。人GPC3是指由UniProtP51654定义的全长蛋白质、其片段或其变体。如本文所使用，“可检测的亲和力”是指以通常至少约10-5M或更低的亲和力常数结合所选靶标的能力。更低的亲和力通常不能通过常规方法诸如ELISA测量，因此是次要的。如本文所使用，本公开内容的蛋白质(例如本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种能够结合CD137和GPC3的融合多肽，其中所述融合多肽包含至少两个任意顺序的亚基，其中第一亚基对CD137是特异性的，而第二亚基对GPC3是特异性的。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.05.18 EP 15167927.1;2016.01.08 EP 16150508.61.一种能够结合CD137和GPC3的融合多肽，其中所述融合多肽包含至少两个任意顺序的亚基，其中第一亚基对CD137是特异性的，而第二亚基对GPC3是特异性的。2.根据权利要求1所述的融合多肽，其中所述第一亚基包含对CD137具有结合特异性的全长免疫球蛋白或其抗原结合结构域，并且其中所述第二亚基包含对GPC3具有结合特异性的脂质运载蛋白突变蛋白。3.根据权利要求1所述的融合多肽，其中所述第一亚基包含对CD137具有结合特异性的脂质运载蛋白突变蛋白，并且其中所述第二亚基包含对GPC3具有结合特异性的脂质运载蛋白突变蛋白。4.根据权利要求3所述的融合多肽，其中所述融合多肽还包含免疫球蛋白-Fc片段。5.根据权利要求3所述的融合多肽，其中所述融合多肽还包含对CD137特异性的第三亚基。6.根据权利要求5所述的融合多肽，其中所述第三亚基包含对CD137具有结合特异性的脂质运载蛋白突变蛋白。7.根据权利要求1所述的融合多肽，其中当在基本如实施例3、实施例8或实施例15中描述的ELISA试验中测量时，所述融合多肽能够以至少约5nM的EC50值结合CD137。8.根据权利要求1所述的融合多肽，其中当在基本如实施例8或实施例15中描述的ELISA试验中测量时，所述融合多肽能够以与包含于所述融合多肽中的对CD137特异的所述脂质运载蛋白突变蛋白或所述抗体的EC50值至少一样好或更优的EC50值结合CD137。9.根据权利要求1所述的融合多肽，其中当通过基本如实施例6、实施例11或实施例18中描述的表面等离子体共振(SPR)分析测量时，所述融合多肽能够以至少约5nM的KD的亲和力结合CD137。10.根据权利要求1所述的融合多肽，其中当在基本如实施例2、实施例7、实施例12或实施例14中描述的ELISA试验中测量时，所述融合多肽能够以至少约5nM的EC50值结合GPC3。11.根据权利要求1所述的融合多肽，其中当在基本如实施例7、实施例12或实施例14中描述的ELISA试验中测量时，所述融合多肽能够以与包含于所述融合多肽中的对GPC3特异的所述脂质运载蛋白突变蛋白的EC50值相当的EC50值结合GPC3。12.根据权利要求1所述的融合多肽，其中当通过基本如实施例5、实施例10或实施例17中描述的表面等离子体共振(SPR)分析测量时，所述融合多肽能够以至少约5nM的KD的亲和力结合GPC3。13.根据权利要求1所述的融合多肽，其中当在基本如实施例4、实施例9、实施例13或实施例16中描述的ELISA试验中测量时，所述融合多肽能够同时结合CD137和GPC3。14.根据权利要求1所述的融合多肽，其中当在基本如实施例4、实施例9、实施例13或实施例16中描述的ELISA试验中测量时，所述融合多肽能够以至少约10nM的EC50值同时结合CD137和GPC3。15.根据权利要求1所述的融合多肽，其中所述融合多肽能够在基本如实施例19中描述的功能性T细胞活化试验中共刺激T细胞应答。16.根据权利要求1所述的融合多肽，其中所述融合多肽能够在基本如实施例19中描述的功能性T细胞活化试验中，在存在T细胞的刺激的情况下诱导IL-2产生。17.根据权利要求1所述的融合多肽，其中所述融合多肽在基本如实施例19中描述的功能性T细胞活化试验中，在不存在T细胞的抗CD3刺激的情况下不诱导IL-2产生。18.根据权利要求1的融合多肽，其中所述融合多肽能够在基本如实施例19中描述的功能性T细胞活化试验中，共刺激采用次最佳浓度的抗CD3和抗CD28抗体刺激的T细胞的活化。19.根据权利要求1所述的融合多肽，其中所述融合多肽能够在基本如实施例20中描述的功能性T细胞活化试验中共刺激T细胞应答。20.根据权利要求1所述的融合多肽，其中所述融合多肽能够在基本如实施例20中描述的功能性T细胞活化试验中诱导IL-2产生。21.根据权利要求1所述的融合多肽，其中所述融合多肽能够在基本如实施例20中描述的功能性T细胞活化试验中以GPC3靶标依赖性方式共刺激T细胞活化。22.根据权利要求1-21中任一项所述的融合多肽，其中所述GPC3特异性脂质运载蛋白突变蛋白在成熟hNGAL(SEQIDNO：2)的线性多肽序列的序列位置36、40、41、49、52、65、68、70、72、73、77、79、81、87、96、100、103、105、106、125、127、132、134、136和/或175处包含至少20个突变的氨基酸残基。23.根据权利要求1-21中任一项所述的融合多肽，其中所述GPC3特异性脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列包含以下与所述成熟hNGAL(SEQIDNO：2)的线性多肽序列相比较的突变的氨基酸残基中的至少一个：Leu36→Val或Arg；Ala40→Leu，Val或Gly；Ile41→Leu，Arg，Met，Gly或Ala；Gln49→Pro或Leu；Tyr52→Arg或Trp；Asn65→Asp；Ser68→Val，Gly，Asn或Ala；Leu70→Arg，Ser，Ala或Val；Arg72→Asp，Trp，Ala或Gly；Lys73→Gly，Arg，Asn，Glu或Ser；Cys76→Val或Ile；Asp77→His，Met，Val，Leu，Thr或Lys；Trp79→Lys，Ser或Thr；Arg81→Gly；Cys87→Ser；Asn96→Arg，Asp，Gln或Pro；Tyr100→Gly，Glu，Pro或Gln；Leu103→Glu，Gln，Asn，Gly，Ser或Tyr；Ser105→Ala；Tyr106→Asn，Ser或Thr；Lys125→Glu；Ser127→Arg或Tyr；Tyr132→Trp或Ile；Lys134→Ala或Phe；Thr136→Ile；和Cys175→Ala。24.根据权利要求1-23中任一项所述的融合多肽，其中所述GPC3特异性脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列在对应于所述成熟hNGAL(SEQIDNO：2)的线性多肽序列的序列位置28的序列位置处不包含突变。25.根据权利要求1-24中任一项所述的融合多肽，其中关于所述GPC3特异性脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列，在所述成熟hNGAL(SEQIDNO：2)的线性多肽序列的位置65处的天然N-糖基化位点Asn在所述突变蛋白的相应序列位置处被去除。26.根据权利要求1-25中任一项所述的融合多肽，其中所述GPC3特异性脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列包含以下氨基酸取代组之一：(a)Leu36→Val；Ile41→Leu；Gln49→Leu；Tyr52→Arg；Asn65→Asp；Ser68→Val；Leu70→Ser；Arg72→Trp；Lys73→Arg；Asp77→His；Trp79→Lys；Arg81→Gly；Cys87→Ser；Asn96→Asp；Tyr100→Gly；Leu103→Gln；Tyr106→Asn；Lys125→Glu；Ser127→Arg；Tyr132→Trp；Lys134→Ala；(b)Leu36→Val；Ala40→Val；Ile41→Arg；Gln49→Pro；Tyr52→Arg；Asn65→Asp；Ser68→Gly；Leu70→Ser；Lys73→Gly；Asp77→His；Trp79→Lys；Arg81→Gly；Cys87→Ser；Asn96→Asp；Tyr100→Gly；Leu103→Glu；Tyr106→Asn；Lys125→Glu；Ser127→Arg；Tyr132→Trp；Lys134→Phe；(c)Leu36→Val；Ala40→Gly；Ile41→Met；Gln49→Leu；Tyr52→Arg；Asn65→Asp；Leu70→Ala；Lys73→Asn；Asp77→His；Trp79→Lys；Arg81→Gly；Cys87→Ser；Asn96→Gln；Tyr100→Gly；Leu103→Glu；Tyr106→Asn；Lys125→Glu；Ser127→Arg；Tyr132→Trp；Lys134→Phe；(d)Leu36→Arg；Ala40→Val；Ile41→Gly；Gln49→Pro；Tyr52→Trp；Asn65→Asp；Ser68→Asn；Leu70→Arg；Arg72→Ala；Lys73→Arg；Asp77→Leu；Trp79→Ser；Arg81→Gly；Cys87→Ser；Asn96→Gln；Tyr100→Glu；Leu103→Asn；Ser105→Ala；Tyr106→Asn；Lys125→Glu；Ser127→Tyr；Tyr132→Ile；Lys134→Phe；Thr136→Ile；(e)Leu36→Arg；Ala40→Val；Ile41→Gly；Gln49→Pro；Tyr52→Trp；Asn65→Asp；Ser68→Asn；Leu70→Arg；Arg72→Ala；Lys73→Arg；Asp77→Thr；Trp79→Ser；Arg81→Gly；Cys87→Ser；Asn96→Gln；Tyr100→Glu；Leu103→Gly；Ser105→Ala；Tyr106→Asn；Lys125→Glu；Ser127→Tyr；Tyr132→Ile；Lys134→Phe；Thr136→Ile；(f)Leu36→Arg；Ala40→Gly；Ile41→Ala；Gln49→Pro；Tyr52→Trp；Asn65→Asp；Ser68→Asn；Leu70→Arg；Arg72→Ala；Lys73→Arg；Asp77→Val；Trp79→Ser；Arg81→Gly；Cys87→Ser；Asn96→Pro；Tyr100→Glu；Leu103→Asn；Ser105→Ala；Tyr106→Ser；Lys125→Glu；Ser127→Tyr；Tyr132→Ile；Lys134→Phe；Thr136→Ile；(g)Leu36→Arg；Ala40→Val；Ile41→Ala；Gln49→Pro；Tyr52→Arg；Asn65→Asp；Ser68→Ala；Leu70→Arg；Arg72→Ala；Lys73→Arg；Asp77→Leu；Trp79→Ser；Arg81→Gly；Cys87→Ser；Asn96→Arg；Tyr100→Glu；Leu103→Tyr；Ser105→Ala；Tyr106→Asn；Lys125→Glu；Ser127→Tyr；Tyr132→Ile；Lys134→Phe；Thr136→Ile；(h)Leu36→Arg；Ala40→Val；Ile41→Ala；Gln49→Pro；Tyr52→Arg；Asn65→Asp；Ser68→Asn；Leu70→Val；Arg72→Ala；Lys73→Gly；Asp77→Lys；Trp79→Ser；Arg81→Gly；Cys87→Ser；Asn96→Arg；Tyr100→Pro；Leu103→Asn；Ser105→Ala；Tyr106→Asn；Lys125→Glu；Ser127→Tyr；Tyr132→Ile；Lys134→Phe；Thr136→Ile；(i)Leu36→Arg；Ala40→Leu；Ile41→Gly；Gln49→Pro；Tyr52→Trp；Asn65→Asp；Ser68→Asn；Leu70→Arg；Arg72→Ala；Lys73→Arg；Asp77→Met；Trp79→Ser；Arg81→Gly；Cys87→Ser；Asn96→Gln；Tyr100→Glu；Leu103→Ser；Ser105→Ala；Tyr106→Asn；Lys125→Glu；Ser127→Tyr；Tyr132→Ile；Lys134→Phe；(j)Leu36→Arg；Ala40→Val；Ile41→Gly；Gln49→Pro；Tyr52→Trp；Asn65→Asp；Ser68→Asn；Leu70→Arg；Arg72→Ala；Lys73→Gly；Cys76→Val；Asp77→Lys；Trp79→Thr；Arg81→Gly；Cys87→Ser；Asn96→Gln；Tyr100→Glu；Leu103→Asn；Ser105→Ala；Tyr106→Thr；Lys125→Glu；Ser127→Tyr；Tyr132→Ile；Lys134→Phe；Cys175→Ala；(k)Leu36→Arg；Ala40→Val；Ile41→Gly；Gln49→Pro；Tyr52→Arg；Asn65→Asp；Ser68→Gly；Leu70→Arg；Arg72→Gly；Lys73→Glu；Cys76→Ile；Asp77→Lys；Trp79→Ser；Arg81→Gly；Cys87→Ser；Asn96→Gln；Tyr100→Gln；Leu103→Asp；Ser105→Ala；Tyr106→Thr；Lys125→Glu；Ser127→Tyr；Tyr132→Ile；Lys134→Phe；Thr136→Ile；Cys175→Ala；和(l)Leu36→Arg；Ala40→Val；Ile41→Gly；Gln49→Pro；Tyr52→Arg；Asn65→Asp；Ser68→Gly；Leu70→Arg；Arg72→Asp；Lys73→Ser；Cys76→Val；Asp77→Thr；Trp79→Ser；Arg81→Gly；Cys87→Ser；Asn96→Gln；Tyr100→Glu；Leu103→Asn；Ser105→Ala；Tyr106→Thr；Lys125→Glu；Ser127→Tyr；Tyr132→Ile；Lys134→Phe；Thr136→Ile；Cys175→Ala。27.根据权利要求1-26中任一项所述的融合多肽，其中所述GPC3特异性脂质运载蛋白突变蛋白不具有N-糖基化位点。28.根据权利要求1-27中任一项所述的融合多肽，其中所述GPC3特异性脂质运载蛋白突变蛋白包含选自SEQIDNOs：4-17或其片段或变体的氨基酸序列，所述片段或变体包含如权利要求22至28中任一项所定义的氨基酸残基。29.根据权利要求1-27中任一项所述的融合多肽，其中所述GPC3特异性脂质运载蛋白突变蛋白与选自SEQIDNOs：4-17的氨基酸序列具有至少85％的序列同一性。30.根据权利要求1-21中任一项所述的融合多肽，其中所述CD137特异性脂质运载蛋白突变蛋白在成熟人泪脂质运载蛋白(SEQIDNO：1)的线性多肽序列的序列位置5、26-31、33-34、42、46、52、56、58、60-61、65、71、85、94、101、104-106、108、111、114、121、133、148、150和153处包含至少一个突变的氨基酸残基。31.根据权利要求30所述的融合多肽，其中所述CD137特异性脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列包含以下与所述成熟人泪脂质运载蛋白(SEQIDNO：1)的线性多肽序列相比较的突变的氨基酸残基中的至少一个：Ala5→Val或Thr；Arg26→Glu；Glu27→Gly；Phe28→Cys；Pro29→Arg；Glu30→Pro；Met31→Trp；Leu33→Ile；Glu34→Phe；Thr42→Ser；Gly46→Asp；Lys52→Glu；Leu56→Ala；Ser58→Asp；Arg60→Pro；Cys61→Ala；Lys65→Arg或Asn；Thr71→Ala；Val85→Asp；Lys94→Arg或Glu；Cys101→Ser；Glu104→Val；Leu105→Cys；His106→Asp；Lys108→Ser；Arg111→Pr...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·欣纳，R·S·贝莱巴，C·罗特，S·奥威尔，C·施洛瑟，
申请(专利权)人：皮里斯制药有限公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE