本发明专利技术的课题是，提供靶核酸的新的检测方法和用于其的试剂盒。设计本发明专利技术的检测的方法，错开具有互补性的、荧光标记的引物/探针和猝灭剂(quencher)标记的探针的解链温度(Tm)，使得荧光标记引物优先地与靶核酸退火。检测方法中，不结合至靶核酸的荧光标记引物/探针与猝灭探针结合，从而不发出荧光，所述方法更加简便廉价，不需要特别的技能、设备，就可能检测靶核酸。
【技术实现步骤摘要】
靶核酸的检测方法本申请是2012年10月25日提交的同名专利技术专利申请201280058995.6的分案申请。
本专利技术涉及靶核酸的检测方法，和用于检测靶核酸的试剂盒。
技术介绍
使用核酸碱基序列的互补性的靶核酸的检测方法以前由DNA杂交开始，设法进行各种改良，迄今为止，特别是在体外的核酸扩增法的确立的同时，可以检测更微量的靶核酸。作为靶核酸的检测方法，开发了使用检测探针的检测方法，所述探针与放射性同位素(RI)，发光剂(luminescentagent)，荧光剂(fluorophore)等的标记结合，含有与靶核酸具有互补性的核酸。出射能量不同的多种RI标记的情况或，出射光的波长不同的多种发光剂(或荧光剂)标记的情况中，可能进行多项目检测。进一步地，也确立了作为Q探针(猝灭探针(QuenchingProbe))法的判断单核苷多态现象(SNP)的方法(专利文献1)。此外，与其相反的是，也存在利用所谓DNA芯片，微阵列等的核酸碱基序列的互补性的靶核酸的检测方法，所述方法以放射性同位素等标记靶核酸，通过使标记的靶核酸和与靶核酸具有互补性的、固相面上固定的寡核苷酸探针一同退火(アニーリソグ)，使得可能同时检测多种靶核酸的量(专利文献2)。一方面，作为核酸扩增法，可举出聚合酶链反应(PCR)(专利文献3和专利文献4)，链置换扩增技术(SDA)(专利文献5)，核酸序列扩增(NASBA)(专利文献6)，滚环扩增(rollingcircleamplification)(RCA)(非专利文献1)，和DNA环介导的恒温扩增(Loop-mediatedisothermalAmplification)(LAMP)(专利文献7)等。这些的核酸扩增法也可能检测靶核酸。进一步地说，也存在如连接酶链反应(LCR)(专利文献8)的使用连接酶的核酸扩增法。现在，作为核酸的扩增方法常用的是PCR法。PCR法是使用与耐热性聚合酶，和与靶核酸具有互补性的2个引物的方法，所述方法通过控制温度进行下文所述这些3个步骤，通过反复进行下文所述这些3个步骤，指数函数地扩增靶核酸，所述这些3个步骤是:(1)双链靶核酸的变性，(2)针对变性的靶核酸的引物的退火，(3)来自引物的伸展反应。电泳移动反应后的扩增产物，通过使用溴乙啶(EtBr)，SYBR绿色(SYBR(登记商标)Green)等的嵌入剂，可能检测扩增产物的有无。此外，也存在前述伸展反应的时候，通过使用附加了荧光剂的核酸碱基的检测扩增产物的方法。进一步地，也确立了，通过使用荧光剂和猝灭剂(quencher)，定量地检测靶核酸的扩增的方法(专利文献9)。具体地说，在PCR扩增反应的时候添加，以TaqMan(登记商标)探针为代表的，邻接附加了荧光剂和猝灭剂的寡核苷酸探针，进行PCR反应。PCR的前述步骤(2)中，该探针也与靶核酸一同退火，伴随步骤(3)的伸展反应，通过聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性分解该探针，通过检测由猝灭剂游离的荧光剂的出射光，可能检测靶核酸。以通过PCR的扩增作为前提，针对使用如此的荧光剂和猝灭剂的组合的核酸检测方法，存在各种设计(专利文献10和专利文献11)。两者以检测PCR的退火的步骤(前述(2))的扩增中的靶核酸为目的而设计，所述步骤向具有互补性的寡核苷酸探针的一方附加荧光剂，另一方附加猝灭剂。LAMP法特征是，对于靶核酸的6个结构域设定4种类的引物(FIP，BIP，F3和B3)，利用链置换反应，在一定温度进行扩增。所述方法可以在1个步骤中进行如下工序:混合含有靶核酸的样品，引物，链置换型DNA合成酶，底物等，通过在一定温度(65℃附近)保温，进行反应，到检测为止的工序。进一步地，通过使用补加环引物B(LB)和/或环引物F(LF)，可能将扩增所需的时间由1/2缩短至1/3(专利文献12)。因为扩增效率高，在15分钟～1小时可以将靶核酸扩增109～1010倍，此外，由于特别高的特异性，也可能判断靶基因序列的有无，从而达到判断扩增产物有无的目的。作为1个如此的方法，使是核酸扩增反应副产物的焦磷酸离子成为不溶性的盐(镁盐)，测定反应液的浊度，或者，使该焦磷酸离子与钙黄绿素锰(カルセイソ-マソガソ)络合物反应，通过检测游离的钙黄绿素(荧光物质)的荧光，检测扩增产物的存在(专利文献13)。进一步地，也确立了使用荧光探针的检测方法(专利文献14和专利文献15)。此外，也报告了，使用荧光标记的引物和猝灭剂标记的探针，检测通过LAMP法扩增的靶核酸的方法(非专利文献2)。具体地说，存在如下方法，所述方法使用荧光标记的引物，通过LAMP法扩增靶核酸，扩增后，添加猝灭剂标记的探针，通过使对靶核酸的扩增没有贡献的游离的荧光标记的引物和猝灭剂标记的探针一同退火，仅仅检测，来自对靶核酸的扩增有贡献的，即，成为扩增产物的一部分的荧光标记的引物的荧光剂的出射光。前述核酸检测方法的任一个均有利有弊，特别地高价精密设备对于反应和检测是必要的，进一步地含有各种工序，因此，其实施需要熟练的地方多，这些的核酸检测技术在特定的研究室内进行，其中，专门进行专门的核酸扩增。此外，例如，前述非专利文献2中记载的检测方法中，扩增反应后添加猝灭剂是必要的，开闭反应容器的盖时，通过扩增产物的飞散可能引起样品间或实验环境的污染。近年，工业，医疗，研究等的各种领域中，核酸扩增试验(NucleicacidAmplificationTest:NAT)的要求提高，同时，试验项目的种类也日益丰富，迄今为止一直增加的核酸扩增试验广泛地普及。例如，以确保对于医药品领域中的血液制剂的多种病毒的安全性为目的而实施的试验中，也可以利用核酸扩增试验。由于如此的普及和一般化的趋势，寻求的是，迄今为止，不仅仅在核酸扩增专用的特定的研究室内进行的核酸扩增试验，在一般实验室或现场工作，床边等的所有场所或场面也可以进行，可以简便使用，并且没有污染试验环境的核酸检测技术，进一步地优选可能同时检测多项目的技术。【现有技术文献】【专利文献】【专利文献1】特开2001-286300号公报【专利文献2】特表2001-521622号公报【专利文献3】特开昭61-274697号公报【专利文献4】特开昭62-000281号公报【专利文献5】特开平5-192195号公报【专利文献6】特开平2-005864号公报【专利文献7】专利第3313358号公报【专利文献8】特开平2-002934公报【专利文献9】特表平6-500021公报【专利文献10】特开平10-262700号公报【专利文献11】特表2004-511227号公报【专利文献12】国际公开第2002/024902号【专利文献13】特开2004-283161号公报【专利文献14】特开2001-272475号公报【专利文献15】国际公开第2009/051214号【非专利文献】【非专利文献1】ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica92:4641-4645(1995)【非专利文献2】JournalofMedicalVirology81:966-972(2009)
技术实现思路
【专利技术解决的课题】本专利技术的课题是，提供新的靶本文档来自技高网...
【技术保护点】
检测样品中存在的1种以上的靶核酸的方法，是含有以下的步骤的检测核酸的方法：(1)向样品添加(A)荧光标记的引物或探针和猝灭剂标记的探针的组合，所述荧光标记的引物或探针：是用荧光剂标记的，是与靶核酸具有互补性的寡核苷酸，且解链温度(Tm)是50～70℃，和所述猝灭剂标记的探针：是被猝灭剂标记的，是与所述荧光标记的引物或探针具有互补性的寡核苷酸，且解链温度(Tm)低于所述荧光标记的引物或探针的解链温度(Tm)、且在25℃以上；或(B)多种的荧光标记的引物或探针和猝灭剂标记的探针的组合，所述荧光标记的引物或探针：是用发光波长不同的荧光剂标记的，是与各自不同的多个靶核酸具有互补性的寡核苷酸，且解链温度(Tm)是50～70℃，和所述猝灭剂标记的探针：是被对应于所述各个荧光剂的猝灭剂标记的，各自是与所述多种荧光标记的引物或探针具有互补性的寡核苷酸，且解链温度(Tm)各自低于所述多种荧光标记的引物或探针的解链温度(Tm)、且在25℃以上；(2)在所述荧光标记的引物或探针的解链温度(Tm)以下、并且在高于所述猝灭剂标记的探针的解链温度(Tm)的温度保温该样品，在保温期间，在等温条件下，利用LAMP法和SMAP2法进行所述靶核酸的扩增；(3)在所述猝灭剂标记的探针的解链温度(Tm)以下的温度，保温该样品；(4)测量结合至靶核酸的荧光标记的引物或探针的荧光。...
【技术特征摘要】
2011.10.31 JP 2011-2381741.检测样品中存在的1种以上的靶核酸的方法，是含有以下的步骤的检测核酸的方法：(1)向样品添加(A)荧光标记的引物或探针和猝灭剂标记的探针的组合，所述荧光标记的引物或探针：是用荧光剂标记的，是与靶核酸具有互补性的寡核苷酸，且解链温度(Tm)是50～70℃，和所述猝灭剂标记的探针：是被猝灭剂标记的，是与所述荧光标记的引物或探针具有互补性的寡核苷酸，且解链温度(Tm)低于所述荧光标记的引物或探针的解链温度(Tm)、且在25℃以上；或(B)多种的荧光标记的引物或探针和猝灭剂标记的探针的组合，所述荧光标记的引物或探针：是用发光波长不同的荧光剂标记的，是与各自不同的多个靶核酸具有互补性的寡核苷酸，且解链温度(Tm)是50～70℃，和所述猝灭剂标记的探针：是被对应于所述各个荧光剂的猝灭剂标记的，各自是与所述多种荧光标记的引物或探针具有互补性的寡核苷酸，且解链温度(Tm)各自低于所述多种荧光标记的引物或探针的解链温度(Tm)、且在25℃以上；(2)在所述荧光标记的引物或探针的解链温度(Tm)以下、并且在高于所述猝灭剂标记的探针的解链温度(Tm)的温度保温该样品，在保温期间，在等温条件下，利用LAMP法和SMAP2法进行所述靶核酸的扩增；(3)在所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：保坂宪光，东出诚司，
申请(专利权)人：荣研化学株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP
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