一种I型糖尿病的基因治疗药物制造技术

本发明专利技术提供一种重组腺相关病毒介导的I型糖尿病基因治疗药物。重组腺相关病毒载体携带包含人miR‑142‑3p靶序列的oFat‑1（optimized Fat‑1，简称oFat‑1）基因表达框。体内实验表明，该重组腺相关病毒载体能够高效地导入体内，持续稳定地表达Fat‑1蛋白，提高体内ω‑3多不饱和脂肪酸含量，增加体内胰岛素含量，维持血糖稳定。结果提示，该重组腺相关病毒载体有希望开发成为一种新的I型糖尿病治疗药物。

【技术实现步骤摘要】
一种I型糖尿病的基因治疗药物
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种重组腺相关病毒载体携带oFat-1基因表达框的1型糖尿病基因治疗药物。
技术介绍
1型糖尿病（Type1diabetes，T1D）是一种多基因的器官特异性自身免疫疾病。疾病发生过程中，机体内特定亚群的T淋巴细胞会攻击自身的胰岛β细胞[1-2]，造成β细胞数量减少，胰岛素分泌不足，体内血糖升高。目前，T1D主要通过每天注射胰岛素进行治疗。然而，注射的胰岛素中不包含C肽。C肽本为胰岛素原加工得到胰岛素时产生的副产物，但却对人体内的微脉管系统[3]、神经元[4]和肾脏[5]具有重要的保护作用。因此，虽然通过注射胰岛素能够有效地控制糖尿病人的血糖浓度，但患者还是不同程度地出现肾脏疾病、神经疾病和心血管疾病等一种或多种其他并发症[6-7]。解决这一问题的关键是降低或抑制自身免疫系统对β细胞的攻击作用，保持β细胞数量的稳定；或者通过异体移植胰岛[8]和干细胞来源的β细胞[9]，人为增加体内的β细胞数量。针对自身免疫系统的药物研发主要为CD3抗体[10]、65kD谷氨酸脱氢酶抗体（GAD65-Ig）[11]和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4抗体（CTLA-4-Ig）[12]等。CD3抗体和GAD65-Ig对早期I型糖尿病人的I期和II期临床试验结果令人兴奋，遗憾的是在III期临床时都未达到主要的疗效终点[10,11,13]。相似地，虽然2年内不间断地静脉注射CTLA-4-Ig，但C肽的浓度仅能在9个月内保持稳定[12]。异体移植胰岛则受制于供体短缺、移植后胰岛易出现纤维化和使用免疫抑制剂带来的副作用等因素的影响，也不可能成为主流的I型糖尿病治疗方式[8,14]。而且单纯地通过免疫抑制和胰岛移植都不能完全消除自身免疫反应对β细胞的攻击作用。因此，为了彻底治愈T1D疾病，有必要基于新的策略来开发药物。回顾T1D发病机制发现，遗传和环境因素都可引起T1D。在某些特定条件下，例如病毒感染、营养失衡等会导致CD4+T细胞功能异常[15]，让自动激活的CD8+T细胞浸入胰岛，杀死β细胞。从而引起β细胞功能异常和数量减少，体内胰岛素分泌量降低，导致T1D出现[1,15]。现有的研究结果表明多种免疫细胞的改变在T1D疾病发生过程中发挥重要作用。其中主要的Th1、Th2、Th17和Tregs细胞都有较为详细的作用阐述[16]。Th1细胞会激活细胞免疫和依赖于吞噬细胞的炎症反应，而Th2细胞则能够引起较强的体液免疫和不依赖于吞噬细胞的炎症反应[17-18]。Th1细胞主导的免疫反应会引起特定器官的自身免疫异常病变[19]。Th1和Th17细胞主要分泌产生IFN-γ和IL-17等炎症因子[20]。这些炎症因子单独或者协同作用，推进T1D疾病的进程。相反，Th2细胞和Tregs细胞则通过分泌IL-4和IL-10等细胞因子，拮抗自身免疫的发生[21]。因此，打破Th细胞的调节异常对阻止自身免疫进程及炎症反应攻击十分重要。充足的证据表明从婴幼儿开始在食物中添加鱼油有利于延缓自身免疫和降低T1D的发病率。长期的年轻人群糖尿病自身免疫研究结果显示1周岁开始服用ω-3多不饱和脂肪酸（polyunsaturatedfattyacids，PUFA）能够显著降T1D家族中小孩的胰岛被自身免疫系统攻击的风险[22]。一项针对挪威人的病例对照研究也得到类似的结果。在该研究中，从1周岁时开始给T1D高风险小孩服用鱼肝油，患病风险显著降低[23]。最近针对遗传性T1D高风险幼儿的多中心、随机、双盲临床试验表明，不管是在妊娠末期还是出生后5个月开始补充DHA，均能显著降低炎症反应的发生[24]。更为重要的是，已有研究表明通过转基因或者基因治疗方式将秀丽线虫中的ω-6PUFA转化为ω-3PUFA的n-3PUFA脱氢酶（Fat-1）基因人源化（mFat-1）后，导入小鼠体内，可提高小鼠体内的ω-3PUFA含量，改变β细胞的免疫微环境，阻止自身免疫系统对β细胞的攻击作用，促进β细胞再生，恢复NOD小鼠体内的胰岛素水平[25-26]。该结果从原理上证明了mFat-1作为治疗基因用于开发T1D基因治疗药物的可能性。但是，如果直接采用前述报道的方法来设计、开发T1D的基因治疗药物仍然会因为风险巨大而困难重重。前述研究中采用了慢病毒载体来携带mFat-1基因表达框。慢病毒载体本身较强的免疫原性[27]、基因组整合可能带来的安全性问题[28]都会影响基因治疗药物的开发进程。而且mFat-1基因本身不在人体内表达，作为一种异源蛋白，人体可能会产生针对表达Fat-1蛋白的免疫反应，直接对导入mFat-1基因并表达Fat-1蛋白的细胞进行免疫攻击。为此，我们在本专利技术中设计了一种新的T1D基因治疗药物rAAV-CAM-oFat-1-142T。为了提高Fat-1基因的表达效率，我们重新对Fat-1基因进行了序列优化合成，得到oFat-1基因。采用人为设计的高效表达启动子CAM调控oFat-1基因表达，并在基因的3’UTR区加入miR-142-3p靶序列，最大限度地抑制oFat-1基因在免疫相关细胞（如抗原呈递细胞）中表达，显著降低产生针对Fat-1蛋白免疫反应的概率[29]。选择更加安全的重组AAV载体[30]携带oFat-1基因表达框。进一步提高了药物开发成功的可能性。腺相关病毒（Adeno-associatedvirus，AAV）因在腺病毒制品中发现而得名[31-32]。AAV是微小病毒科(Parvovirus)成员，包含多种血清型，其基因组为单链DNA[33]，其中AAV2的基因组大小为4682个核苷酸。AAV是依赖性病毒，需要其它病毒如腺病毒、单纯疱疹病毒和人乳头瘤病毒[34]，或辅助因素提供辅助功能才能复制。在没有辅助病毒存在时，AAV感染细胞后其基因组将整合到细胞染色体中成为潜伏状态[35]，而不产生子代病毒。最早分离到的AAV病毒是血清型2型AAV（AAV2）[36]。AAV2基因组长约4.7kb,基因组两端为长度145bp的“反向末端重复序列”（invertedterminalrepeat,ITR），呈回文-发卡结构[37]。基因组中有两个大开放阅读框（ORF），分别编码rep和cap基因。AAV2的全长基因组已克隆至大肠杆菌质粒中[38-39]。ITR是AAV载体基因组的顺式作用元件，在AAV病毒的整合、拯救、复制和基因组包装中发挥重要作用[40]。ITR序列中包含Rep蛋白结合位点（Repbindingsite，RBS）和末端解链位点trs（terminalresolutionsite），能够被Rep蛋白结合识别并在trs处产生切口[41]。ITR序列还可形成独特的“T”字母型二级结构，在AAV病毒的生活周期中发挥重要作用[42]。AAV2基因组其余部分可分为2个功能区，rep基因区和cap基因区[43]。rep基因区编码Rep78、Rep68、Rep52和Rep40四种Rep蛋白。Rep蛋白对于AAV病毒的复制、整合、拯救和包装都具有重要作用。其中Rep78和Rep68与ITR中的末端解链位点trs（terminalresolutionsite）和GAGY重复基序（repeatmotif）本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种秀丽线虫ω‑3多不饱和脂肪酸转化酶基因表达框，其特征在于，（Ⅰ）包含SEQ ID No.1和SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；（Ⅱ）表达框表达产物能够以细胞内的ω‑6多不饱和脂肪酸为底物，催化转化为ω‑3多不饱和脂肪酸。

【技术特征摘要】
1.一种秀丽线虫ω-3多不饱和脂肪酸转化酶基因表达框，其特征在于，（Ⅰ）包含SEQIDNo.1和SEQIDNo.3或SEQIDNo.4所示的核苷酸序列；（Ⅱ）表达框表达产物能够以细胞内的ω-6多不饱和脂肪酸为底物，催化转化为ω-3多不饱和脂肪酸。2.一种重组腺相关病毒载体，其特征在于携带如权利要求1所述的基因表达框。3.权利要求2所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，包括：（1）携带基因组可自我互补形成双链DNA分子；和/或（2）重组腺相关病毒载体血清型包括但不限于AAV1、AAV2、AA...

【专利技术属性】
技术研发人员：田文洪，董小岩，吴小兵，马思思，
申请(专利权)人：北京五加和分子医学研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11