阳离子型蒙脱石用于恶性肿瘤细胞DNA分离提纯的方法技术

本发明专利技术涉及一种阳离子型蒙脱石在恶性肿瘤细胞DNA分离提纯中的应用，通过采用十二烷基硫酸钠溶液对海拉细胞进行裂解，经加热、超声后得到细胞裂解液，然后将阳离子型蒙脱石悬浊液，以醋酸钠调节pH至5.0～6.0，加入到细胞裂解液中进行DNA吸附，吸附后离心分离，以洗脱液洗涤下层沉淀进行DNA脱附。本发明专利技术通过对成本低廉的蒙脱石进行改性，改性后得到的阳离子型蒙脱石可快速高效的提纯恶性肿瘤细胞DNA，同时对恶性肿瘤细胞DNA提取量可按需调控，其分离提纯过程不会对恶性肿瘤细胞DNA的结构造成破坏。

【技术实现步骤摘要】
阳离子型蒙脱石用于恶性肿瘤细胞DNA分离提纯的方法
本专利技术涉及恶性肿瘤细胞DNA的分离提纯，具体涉及一种阳离子型蒙脱石在恶性肿瘤细胞DNA分离提纯中的应用。
技术介绍
肿瘤是严重危害人类健康的疾病之一。肿瘤细胞在坏死、凋亡后释放出可以在人体血液系统中不断循环的肿瘤基因组游离DNA片段，称为ctDNA。ctDNA可无创地用于肿瘤的早期诊断、发展走向以及预后判断等，是一种应用前景广泛的肿瘤标志物。一个100g(3×1010个癌细胞)的肿瘤，每天约有3.3％的肿瘤细胞DNA进入血液循环。DNA作为遗传信息的载体，存储着与人体疾病相关的重要信息。实现恶性肿瘤细胞DNA的检测可以为人体的疾病走向与潜在隐患进行预测。唐旖旎等(有机与无机改性蒙脱石对鲑鱼精DNA吸附特征研究功能材料2012年第13期(43)卷)通过Fe3+及Al3+在蒙脱石层间形成聚羟基Fe/Al化合物达到柱撑效果，讨论该聚羟基Fe/Al蒙脱石对鲑鱼精DNA的吸附特征，但未对脱附后的DNA能否于细胞中成功表达进行讨论，同时根据文中对DNA吸附量的排序，聚羟基Fe/Al制备出的无机柱撑蒙脱石对DNA的吸附量小于原材料。当前能够成功提取DNA并表达的商品化试剂盒包括离心柱试剂盒和磁珠试剂盒，但两种试剂盒均存在诸如成本高、不便于高通量操作等缺陷。本专利技术涉及的蒙脱石作为一种天然产出的层状硅酸盐矿物，具有材料易得、成本低廉、无明显毒性和对恶性肿瘤细胞DNA提取量可按需调控的优点，改性后阳离子型蒙脱石对恶性肿瘤细胞DNA的吸附效率最高可达原料的4.5倍左右，有望实现恶性肿瘤的早期预测并降低恶性肿瘤试剂盒产品生产成本。
技术实现思路
针对现有诊断试剂盒中提纯模型单一、不便于高通量操作和材料合成成本高等方面的问题，本专利技术提出了一种阳离子型蒙脱石在恶性肿瘤细胞DNA分离提纯中的应用，通过对成本低廉的蒙脱石进行改性，改性后得到的阳离子型蒙脱石可快速高效的提纯恶性肿瘤细胞DNA，同时对恶性肿瘤细胞DNA提取量可按需调控，其分离提纯过程不会对恶性肿瘤细胞DNA的结构造成破坏。为了达到上述目的，本专利技术提出了一种阳离子型蒙脱石在恶性肿瘤细胞DNA分离提纯中的应用，包括以下步骤：(1)采用十二烷基硫酸钠溶液对海拉细胞进行裂解，细胞裂解液经加热、超声后冻存备用；(2)将阳离子型蒙脱石配为悬浊液，以醋酸钠调节pH至5.0～6.0，加入步骤(1)所得细胞裂解液进行DNA吸附，离心分离，取上清液并测定其中的DNA含量，下层沉淀备用。(3)以洗脱液洗涤步骤(2)所得下层沉淀，离心分离，取上清液并测定其中的DNA含量。所述步骤(1)中加热温度为80～100℃，时间为3～10min，超声振幅为20％，功率为500W。所述步骤(1)中十二烷基硫酸钠溶液的质量分数为1％～5％。所述步骤(2)中悬浊液的质量浓度为20g/L～50g/L。所述步骤(2)中阳离子型蒙脱石为锂离子型蒙脱石或铝离子型蒙脱石中的一种。所述锂离子型蒙脱石或铝离子型蒙脱石的制备方法为：将钙基蒙脱石加入到碳酸锂或硝酸铝溶液中，钙基蒙脱石与碳酸锂或硝酸铝的质量比为1：0.1～0.8，于50～80℃下恒温水浴搅拌，离心分离，干燥即得。所述步骤(3)中的洗脱液为去离子水、Tris-HCl溶液或EDTA溶液中的一种。本专利技术的优点和有益效果在于：(1)基于DNA螺旋结构中带负电的磷酸基团与钙基蒙脱石表面的阳离子架桥机理，制备了一种阳离子型蒙脱石，根据矿物在水溶液中的双电层理论，通过外加阳离子调控钙基蒙脱石的双电层，提升钙基蒙脱石的分散效果，从而增强阳离子型蒙脱石与恶性肿瘤细胞DNA的吸附作用，快速高效提纯恶性肿瘤细胞DNA。(2)以不同价态离子对钙基蒙脱石进行改性，改性前后仍以离子形式存在，用于水溶液体系下恶性肿瘤细胞DNA的吸附脱附，降低恶性肿瘤细胞DNA分离提纯材料制备成本，同时对DNA的提取量可根据实际情况按需调控，可少量提取亦可高通量操作。(3)经吸附和脱附后的恶性肿瘤细胞DNA能够转染至细胞中成功表达，分离提纯过程不会对恶性肿瘤细胞DNA的结构造成破坏。附图说明图1为本专利技术阳离子型蒙脱石的XRD图。图2为阳离子改性过程中，对应阳离子改性至钙基蒙脱石中的效率。图3为阳离子型蒙脱石的吸附效率图4为脱附后的恶性肿瘤细胞DNA转染表达图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本说明书中的术语“钙基蒙脱石”的化学式(Na,Ca)0.33(Al,Mg)2[Si4O10](OH)2·nH2O，在一些形式中，钙基蒙脱石为层状结构硅酸盐矿物。本说明书实施例中的蒙脱石为浙江三鼎科技有限公司的标准产品，产地为湖北鄂州。实施例1细胞裂解：在直径为6cm的培养皿中培养海拉细胞，后加入500μL2％的十二烷基硫酸钠溶液进行裂解，细胞裂解液移入EP管中并在80℃下加热5min，在振幅为20％、功率为500W条件下超声，冻存于-20℃的冰箱备用。锂离子型蒙脱石的制备：向9mL去离子水中溶解Li2CO30.23g，加入钙基蒙脱石1.00g，60℃下恒温水浴反应24h，离心分离，60℃干燥24h，密闭保存于干燥皿中备用，标记为0.5Li-MMT。DNA吸附：取30g/L的锂离子型蒙脱石悬浊液70μL，加入20μL细胞裂解液和10μLpH为5.0的醋酸钠溶液，反应2min后在5000g的向心加速度下离心2min，取上清液并以琼脂凝胶电泳法测定其中的DNA的含量。DNA脱附：将已吸附DNA的阳离子型蒙脱石离心分离，所得沉淀物分散于100μL去离子水中，反应2min后在5000g的向心加速度下离心2min，取上清液并以琼脂凝胶电泳法测定其中的DNA的含量。实施例2细胞裂解：在直径为6cm的培养皿中培养海拉细胞，后加入500μL2％的十二烷基硫酸钠溶液进行裂解，细胞裂解液移入EP管中并在90℃下加热5min，在振幅为20％、功率为500W条件下超声，冻存于-20℃的冰箱备用。锂离子型蒙脱石的制备：向9mL去离子水中溶解Li2CO30.47g，加入钙基蒙脱石1.00g，60℃下恒温水浴反应24h，离心分离，60℃干燥24h，密闭保存于干燥皿中备用，标记为Li-MMT。DNA吸附：取30g/L的锂离子型蒙脱石悬浊液70μL，加入20μL细胞裂解液和10μLpH为5.0的醋酸钠溶液，反应2min后在5000g的向心加速度下离心2min，取上清液并以琼脂凝胶电泳法测定其中的DNA的含量。DNA脱附：将已吸附DNA的阳离子型蒙脱石离心分离，所得沉淀物分散于100μLpH为8.0的Tris-HCl溶液中，反应2min后在5000g的向心加速度下离心2min，取上清液并以琼脂凝胶电泳法测定其中的DNA的含量。实施例3细胞裂解：在直径为6cm的培养皿中培养海拉细胞，后加入500μL2％的十二烷基硫酸钠溶液进行裂解，细胞裂解液移入EP管中并在100℃下加热5min，在振幅为20％、功率为500W条件下超声，冻存于-20℃的冰箱备用。锂离子型蒙脱石的制备：向9mL去离子水中溶解Li2CO30.71g，加入钙基蒙脱石1.00g，60℃下恒温水浴反本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种阳离子型蒙脱石在恶性肿瘤细胞DNA分离提纯中的应用，其特征在于，包括以下步骤：(1)在海拉细胞培养皿中加入十二烷基硫酸钠溶液进行裂解，细胞裂解液经加热、超声后冻存备用；(2)将阳离子型蒙脱石配为悬浊液，以醋酸钠调节pH至5.0～6.0，加入步骤(1)所得细胞裂解液进行DNA吸附，离心分离，取上清液并测定其中的DNA含量，下层沉淀备用；(3)以洗脱液洗涤步骤(2)所得下层沉淀，离心分离，取上清液并测定其中的DNA含量。

【技术特征摘要】
1.一种阳离子型蒙脱石在恶性肿瘤细胞DNA分离提纯中的应用，其特征在于，包括以下步骤：(1)在海拉细胞培养皿中加入十二烷基硫酸钠溶液进行裂解，细胞裂解液经加热、超声后冻存备用；(2)将阳离子型蒙脱石配为悬浊液，以醋酸钠调节pH至5.0～6.0，加入步骤(1)所得细胞裂解液进行DNA吸附，离心分离，取上清液并测定其中的DNA含量，下层沉淀备用；(3)以洗脱液洗涤步骤(2)所得下层沉淀，离心分离，取上清液并测定其中的DNA含量。2.根据权利要求1所述的阳离子型蒙脱石在恶性肿瘤细胞DNA分离提纯中的应用，其特征在于，所述步骤(1)中加热温度为80～100℃，时间为3～10min，超声振幅为20％，功率为500W。3.根据权利要求1所述的阳离子型蒙脱石在恶性肿瘤细胞DNA分离提纯中的应用，其特征在于，所述步骤(1)中十二烷基硫酸钠溶液的质量分数为1％～5％。4.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：张毅，杨华明，谢虹忆，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43