提高基因组覆盖度的单细胞全基因组扩增及文库构建方法技术

本发明专利技术提供一种提高基因组覆盖度的单细胞全基因组扩增及文库构建方法。本发明专利技术的单细胞基因组扩增方法，采用多重置换扩增方法对单细胞基因组进行扩增，其包括：使一组引物、DNA聚合酶和单细胞基因组在溶液中接触；以及对所述溶液进行扩增，使得进行所述单细胞基因组的扩增反应；其中，所述扩增的时间为0.5小时以上且2小时以下。

【技术实现步骤摘要】
提高基因组覆盖度的单细胞全基因组扩增及文库构建方法
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种可提高基因组覆盖度的单细胞全基因组扩增及二代测序文库构建方法。
技术介绍
单细胞测序技术(single-cellsequenceing)于2013年荣膺《NatureMathods》年度技术，在癌症、辅助生殖和免疫学等领域具有广阔的应用前景。单细胞基因组测序是在单细胞水平对全基因组进行扩增和测序的一项技术，其原理是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增，获得高覆盖率的完整的基因组后，进行高通量测序，用于揭示细胞群体差异和细胞进化关系。单细胞的基因组是极其微量的，为满足文库质控，上机测序以及其他检测的需求，必须进行全基因组扩增以实现基因组线型或指数型增长。然而，单细胞基因组测序的主要流程包括：单细胞分离-单细胞全基因组扩增-测序文库制备-测序及数据分析。目前，就单细胞全基因组扩增而言，主要的扩增方法有三种：MDA(多重置换扩增)[1]、DOP-PCR(简并寡核苷酸引物PCR扩增)[2]以及MALBAC(多次退火成环循环扩增)[3]。MDA是一种等温的链置换扩增反应，其使用随机引物在多位点和模板链结合，接着利用phi29DNA聚合酶很强的模板结合和置换能力实现对全基因组的扩增。在扩增单细胞基因组后，进行测序文库的构建。目前，主流的基因组文库构建方法依照的是IlluminaTruSeqDNASamplePrepWorkflow，其包括基因组DNA片段化、DNA片段末端修复、DNA片段3'端加“A”、DNA片段连接Y型接头、PCR富集等步骤。从方法学角度来看，获得高覆盖率高保真性的单细胞全基因组扩增产物是准确全面的测序结果的保障。然而，就基因组覆盖度而言，上述三种单细胞全基因组扩增方法均不理想，最高也仅为60％左右，且呈现MDA>MALBAC>DOP-PCR的趋势[4]。参考文献1.DeanFB,NelsonJR,GieslerTL,LaskenRS.2001.RapidamplificationofplasmidandphageDNAusingphi29DNApolymeraseandmultiply-primedrollingcircleamplification.GenomeRes.11:1095–99。2.TeleniusH,CarterNP,BebbCE,NordenskjoM,PonderBA,TunnacliffeA.1992.Degenerateoligonucleotide-primedPCR:generalamplificationoftargetDNAbyasingledegenerateprimer.Genomics13:718–25。3.ZongC,LuS,ChapmanAR,XieXS.2012.Genome-widedetectionofsingle-nucleotideandcopy-numbervariationsofasinglehumancell.Science338:1622–26。4.Huang,L.,etal.,Single-CellWhole-GenomeAmplificationandSequencing:MethodologyandApplications.AnnuRevGenomicsHumGenet,2015.16:p.79-102。
技术实现思路
鉴于上述现有技术中存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种能够提高基因组覆盖度的单细胞全基因组扩增及文库构建方法。本专利技术的专利技术人为解决上述技术问题进行了深入研究，结果发现：通过采用MDA方法扩增单细胞基因组，并显著减少扩增的时间，能够得到高基因组覆盖度的单细胞基因组扩增产物，从而完成了本专利技术。即，本专利技术包括：1.一种单细胞基因组扩增方法，其采用多重置换扩增方法对单细胞基因组进行扩增，其包括：使一组引物、DNA聚合酶和单细胞基因组在溶液中接触；以及对所述溶液进行扩增，使得进行所述单细胞基因组的扩增反应；其中，所述扩增的时间为0.5小时以上且2小时以下。2.根据项1所述的扩增方法，其中，所述扩增为0.7小时以上且1.5小时以下。3.根据项1或2所述的扩增方法，其中，所述引物为具有随机核苷酸的核苷酸序列。4.根据项1～3中任选一项所述的扩增方法，其中，所述引物具有5～10个碱基的长度。5.根据项1～4中任一项所述的扩增方法，其中，所述引物具有6个碱基的长度。6.根据项1～5中任一项所述的扩增方法，其中，所述扩增反应是等温扩增。7.根据项1～6中任一项所述的扩增方法，其中，所述扩增反应在促进所述引物与所述单细胞基因组杂交的条件下进行。8.根据项1～7中任一项所述的扩增方法，其中，所述DNA聚合酶选自Phi29DNA聚合酶、TtsDNA聚合酶、M2DNA聚合酶、VENTDNA聚合酶、T5DNA聚合酶、PRD1DNA聚合酶、BstDNA聚合酶以及REPLI-gscDNA聚合酶。9.一种单细胞基因组测序用DNA文库的构建方法，其包括：采用项1～8中任一项所述的扩增方法对单细胞基因组进行扩增，得到单细胞基因组扩增产物。10.根据项9所述的构建方法，其还包括：将所述单细胞基因组扩增产物片段化，得到片段化产物；将所述片段化产物进行末端修复，得到末端修复产物；将所述末端修复产物进行3'端加A，得到3'端加A产物；将所述3'端加A产物进行加接头，得到加接头产物；以及将所述加接头产物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。专利技术效果根据本专利技术，能够提高单细胞全基因组扩增产物及单细胞全基因组测序用DNA文库的基因组覆盖度。专利技术的具体实施方式本说明书中提及的科技术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义，如有冲突以本说明书中的定义为准。在本说明书中，基因组覆盖度是指测序获得的序列占整个基因组的比例。首先，在一个方面中，本专利技术提供一种单细胞基因组扩增方法(本专利技术的扩增方法)，其采用多重置换扩增方法对单细胞基因组进行扩增，其包括：使一组引物、DNA聚合酶和单细胞基因组在溶液中接触；以及对所述溶液进行扩增，使得进行所述单细胞基因组的扩增反应；其中，所述扩增的时间为0.5小时以上且2小时以下。关于多重置换扩增方法，可以参见例如美国专利US6,124,120。该多重置换扩增方法通常包括使一组引物、DNA聚合酶和靶核酸在溶液中接触；以及对所述溶液进行扩增，使得进行所述靶核酸的扩增反应以复制该靶核酸；其中，该靶核酸的复制产生复制链，并且在复制期间，所述复制链中的至少一条通过另一复制链的链置换复制而从该靶核酸上置换下来。在本专利技术中，所述单细胞基因组即相当于上述靶核酸。就单细胞基因组的扩增而言，通常认为需要更长的扩增反应时间，例如常用于单细胞基因组扩增的REPLI-gSingleCellKit(Qiagen公司)的操作说明书中规定的扩增反应时间为8小时。但本专利技术的专利技术人研究发现，延长扩增反应会损害单细胞全基因组扩增产物及单细胞全基因组测序用DNA文库的基因组覆盖度，所述基因组覆盖度在扩增反应时间为约1小时时最高，而且，当扩增反应时间超过2小时时，扩增产物的产量已经达到饱和。因此，从提高基因组覆盖度的角度来看，所述扩增反应时间(扩增本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单细胞基因组扩增方法，其采用多重置换扩增方法对单细胞基因组进行扩增，其包括：使一组引物、DNA聚合酶和单细胞基因组在溶液中接触；以及对所述溶液进行扩增，使得进行所述单细胞基因组的扩增反应；其中，所述扩增的时间为0.5小时以上且2小时以下。

【技术特征摘要】
1.一种单细胞基因组扩增方法，其采用多重置换扩增方法对单细胞基因组进行扩增，其包括：使一组引物、DNA聚合酶和单细胞基因组在溶液中接触；以及对所述溶液进行扩增，使得进行所述单细胞基因组的扩增反应；其中，所述扩增的时间为0.5小时以上且2小时以下。2.根据权利要求1所述的扩增方法，其中，所述扩增的时间为0.7小时以上且1.5小时以下。3.根据权利要求1或2所述的扩增方法，其中，所述引物为具有随机核苷酸的核苷酸序列。4.根据权利要求1～3中任选一项所述的扩增方法，其中，所述引物具有5～10个碱基的长度。5.根据权利要求1～4中任一项所述的扩增方法，其中，所述引物具有6个碱基的长度。6.根据权利要求1～5中任一项所述的扩增方法，其中，所述扩增反应是等温扩增。7.根据权利要求1～6中任一项所述的扩增方法，其中，所述扩增反应在促进所述引...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁峻彬，张超，洪燕，刘涛，玄兆伶，李大为，陈重建，
申请(专利权)人：安诺优达基因科技北京有限公司，浙江安诺优达生物科技有限公司，安诺优达义乌医学检验有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11