一种新型漆酶及其基因、工程菌、制备与应用制造技术

本发明专利技术属于酶的基因工程技术领域，涉及一种来源于地衣芽孢杆菌的新型漆酶、基因、工程菌及其制备与应用，其技术方案是利用分子生物学手段和基因工程技术，通过菌种筛选获得一株能够产生漆酶的地衣芽孢杆菌，通过PCR技术扩增出该新型漆酶的基因，然后将该新型漆酶基因，分别在枯草芽胞杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统中进行表达，分别得到枯草芽胞杆菌高稳定性漆酶重组菌株和毕赤酵母高稳定性漆酶游离表达重组菌株，实现新型漆酶的制备。同时该新型细菌漆酶食品加工、染料脱色方面有较好的作用。

【技术实现步骤摘要】
一种新型漆酶及其基因、工程菌、制备与应用
：本专利技术涉及一种来源于地衣芽孢杆菌的新型漆酶及其基因、工程菌、制备方法和应用，具体涉及通过基因工程技术和分子生物学手段获得表达该新型漆酶的重组表达菌株，以及该细菌漆酶蛋白在染料脱色工业上的应用，属于酶的基因工程

技术介绍
：漆酶(Laccase，E.C.1.10.3.2)，又称为酚酶、多酚氧化酶，是一种含铜的多酚氧化酶。最早是由日本学者发现，10多年后又在真菌中发现了这种酶，并将其命名为漆酶。漆酶大多为500-550个左右的氨基酸组成的单体糖蛋白，具有N-端分泌肽，分子量为50-500kDa，糖基含量10％-80％，它与抗坏血酸氧化酶、血浆铜蓝蛋白、吩嗪合酶、胆红素氧化酶、二氢地曲菌素氧化酶、硫赭曲菌素氧化酶和FET3同属蓝色多铜氧化酶家族。漆酶是具有重要应用价值的绿色催化剂，广泛存在于真菌、细菌、昆虫和高等动植物体内。相对于动植物而言，微生物漆酶来源比较丰富，主要是真菌和细菌两大类。真菌漆酶糖基化程度高，占酶分子的10％～49％，包括葡萄糖、半乳糖、氨基己糖、岩藻糖、阿拉伯糖等，糖基的组分和比例差异会产生同工酶，糖基也有利于漆酶结构的热稳定性。而细菌漆酶不需要糖基化的修饰，漆酶通常以单体蛋白体的形式存在，酸性pH催化效率较高，适宜温度低的环境。真菌漆酶来源广泛，产漆酶的真菌绝大多数为担子菌亚门(Basidiomycotina)，约占80％。目前工业化的商品漆酶主要来源于真菌，但是，一般真菌漆酶在酸性条件下(pH4-6)和30-55℃下保持较高的活性，而造纸和纺织等工业领域往往伴随着高温、强碱等反应条件，使真菌漆酶的应用受到限制且使用成本较高。而且丝状真菌生长周期长，对培养基要求较高，在发酵罐中容易受到较高的机械损伤，这些问题严重影响了真菌漆酶在工业上的应用。细菌漆酶包括芽胞杆菌属的CotA蛋白、海单胞菌的PpoA蛋白、大肠杆菌CueO蛋白等，与真菌漆酶相比，细菌漆酶在铜离子抗性和热稳定性等方面更具有优势。而且细菌漆酶具有自己一些独特的优点：细菌漆酶没有糖基化修饰，分子组成单一，绝大多数为单体酶，最适pH范围广、温度稳定性好、存在Cu2+抗性等。这些性质正是目前工业上漆酶应用所需要的。因此，细菌漆酶的研究对于漆酶应用领域的扩展具有十分重要的意义。目前，关于细菌漆酶的研究很少，更多具有高活力高稳定性能力的细菌漆酶基因有待进一步发掘和研究。由于漆酶来源不同，并且不同来源的漆酶在结构和性质方面存在一定的差别，但是大部分漆酶都具有三个典型的结构，即肽链、糖配基和铜原子。漆酶多为糖基化酶，不易结晶，稳定性好，氧化还原电位高(780mV)，作用底物范围广，可氧化多酚、二元胺、芳香胺、对苯二酚、氨基酚、芳香硫醇等。漆酶与木素过氧化物酶、苦瓜过氧化物酶等酶一样，能氧化小分子物质并进一步氧化一些不能被其它酶直接氧化的物质，这些小分子物质称为介体。漆酶与氧气、介体结合可以氧化本来不能氧化的不含酚基的化合物。特别是在生物消除和有机膦酸酯消毒方面，通过有效的介体，漆酶可以催化降解异型生物质。介体的发现，显著扩大了漆酶底物范围，使得漆酶具有更加广阔的应用前景。目前，漆酶已被应用于纸浆造纸、有机合成、污水处理、食品等行业，此外，漆酶在服装行业、生物传感器、环境修复、毒品检测和清除军用化学毒剂等方面也有其相关应用。枯草芽胞杆菌属于革兰氏阳性菌。枯草芽胞杆菌表达系统具有以下优点：1、能够高效地分泌各种蛋白质；2、许多枯草芽胞杆菌在发酵工业上的使用已有相当长的历史，无致病性，不产生任何内毒素；3、芽胞杆菌属微生物遗传学背景研究的十分清楚，并且生长迅速，对营养物质无特殊要求等优点；4、密码子偏爱性不明显；5、发酵过程简单，枯草芽胞杆菌属于好氧菌，无需厌氧发酵设备，发酵结束后，简单的分离发酵液和细菌菌体，即可进入目的蛋白的分离、纯化回收阶段；6、具有抗逆性，可以生产多种耐热性酶制剂。毕赤酵母是一种单细胞低等真核生物，培养条件普通，生长繁殖速度迅速。毕赤酵母系统用于表达基因工程产品时，可以大规模生产，有效降低了生产成本。毕赤酵母表达系统在表达外源目的蛋白时具有很多优点，具有广阔的前景，适合工业化和规模化生产，该表达系统的优点主要表现在：1、表达量高：毕赤酵母表达系统的表达载体，是以醇氧化酶基因的启动子启动表达的，其外源目的蛋白的表达量很高，P.pastoris的表达量比一般表达系统的表达量(常用表达系统的表达量一般在毫克级)高10倍甚至100倍。2、稳定性高：毕赤酵母表达系统的表达载体通过整合在酵母的染色体上而存在，并且随染色体的复制而复制，不是以质粒自我复制的形式存在，因此重组菌株的稳定性很高。3、高分泌表达：毕赤酵母表达系统的表达载体中a因子前导序列是一个具有很好的分泌效果的分泌信号序列，能够通过一定的途径使表达产物分泌到细胞外，同时减轻了宿主细胞的代谢负荷，有利于细胞的持续生长。4、目的蛋白翻译后的加工和修饰：毕赤酵母具有真核生物完整的亚细胞结构，能够进行真核生物蛋白翻译后的加工修饰过程(如糖基化、脂酞化、磷酸化、蛋白裂解、折叠以及二硫键的形成等)，从而使分泌蛋白的结构更接近于天然蛋白，而且糖基化程度合适，适于临床使用。5、遗传背景研究较清楚，能够通过基因表达调控机制实现目的蛋白的高水平表达。6、易于进行工业化生产，毕赤酵母属于单细胞微生物，具有生产成本低，营养要求简单(酵母的碳源一般为甘油、葡萄糖以及甲醇等)，发酵工艺简单，可进行高密度发酵等优点，酵母具有大规模发酵生产外源蛋白的潜力，而且酵母表达系统自我分泌的杂蛋白很少，对于目的蛋白的纯化有利。毕赤酵母表达系统已成为现代分子生物学研究最重要的工具和模型，是表达外源基因较为理想的工具。在本专利技术中，新型漆酶编码基因来源于地衣芽孢杆菌，它属于细菌，对地衣芽孢杆菌基因组中新型漆酶编码基因进行克隆，并将新型漆酶基因在枯草芽胞杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统中进行表达，分别得到枯草芽胞杆菌高稳定性漆酶重组菌株和毕赤酵母高稳定性漆酶游离表达重组菌株，重组菌株发酵后，经过相应的处理，可以得到高稳定性漆酶催化剂，并且该新型重组漆酶可以对蒽醌类和偶氮类染料进行脱色。
技术实现思路
：本专利技术的目的在于克服和避免目前工业上生产漆酶所存在的不足之处，并提供一种来源于地衣芽孢杆菌的新型细菌漆酶、其编码基因以及表达该新型细菌漆酶基因的工程菌株。本专利技术实现目的的技术路线如下：以地衣芽孢杆菌的基因组为模板，并根据已报道的地衣芽孢杆菌漆酶成熟肽基因，分析其保守序列，设计本专利技术的漆酶成熟肽基因的扩增引物P1和P2、P3和P4，其中，上游引物P1和下游引物P2是用来扩增在枯草芽胞杆菌中表达的目的基因，上、下游引物分别引入限制性酶切位点EcoRI、NotI；上游引物P3和下游引物P4是用来扩增在毕赤酵母GS115中表达的目的基因，上、下游引物分别引入限制性酶切位点EcoRI、NotI。通过PCR克隆获得地衣芽孢杆菌的漆酶基因Lac，将其分别与pBSA43载体和pPIC9K载体分别连接后，构建重组质粒pBSA43-Lac和pPIC9K-Lac；转化大肠杆菌JM109，获得重组菌株JM109/pBSA43-Lac和JM109/pPIC9K-Lac。再次将验证正确的重组本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种来源于地衣芽孢杆菌的漆酶，其特征在于，所述漆酶的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO：2所示。

【技术特征摘要】
1.一种来源于地衣芽孢杆菌的漆酶，其特征在于，所述漆酶的氨基酸序列如序列表中的SEQIDNO：2所示。2.根据权利要求1所述的一种来源于地衣芽孢杆菌的漆酶，其特征在于，编码所述漆酶的基因为Lac，其碱基序列如序列表SEQIDNO：1所示。3.根据权利要求1所述的一种来源于地衣芽孢杆菌的漆酶，其特征在于，所述漆酶的制备方法包括如下步骤：(1)将权利要求2所述的基因进行酶切，与表达载体连接得到新的重组载体；(2)将重组载体转化入宿主细胞中，得到重组菌株，之后将重组菌株发酵，得到高稳定性漆酶。4.含有权利要求2所述的漆酶基因的克隆载体...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘逸寒，李玉，路福平，付禹，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津,12