低分子量和极低分子量肝素获取工艺制造技术

本申请涉及低分子量和极低分子量肝素获取工艺。本发明专利技术指的是涵盖肝素‑苯索氯胺盐中肝素钠盐化、有机介质解聚和形成碱性金属盐或碱土盐的盐化阶段的低分子量(HBPM)和极低分子量(HMBPM)肝素制备工艺。也可以指通过本发明专利技术中所述工艺获取的产物。

【技术实现步骤摘要】
低分子量和极低分子量肝素获取工艺本申请是申请日为2013年8月2日、申请号为“201380041068.8”、专利技术名称为“低分子量和极低分子量肝素获取工艺”的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申请PCT/ES2013/070575的中国国家阶段申请。
本专利技术指的是低分子量(HBPM)和极低分子量(HMBPM)肝素制备工艺。
技术介绍
肝素是一种由糖醛酸(L-艾杜糖醛苷或D-葡萄糖醛酸)和D-氨基葡萄糖交替组成的黏多糖硫酸脂。L-艾杜糖醛苷可以是2-O-硫酸化的，D-氨基葡萄糖可以为N-硫酸化和/或6-O-硫酸化的，小范围内也可以是N-乙酰化或3-O-硫酸化的(《肝素寡糖主要成分量化和映射》LinhardtRJ，RiceKG，KimYSetal.BiochemJ1988；254：781-787)。肝素优先作为钠盐而使用，但也可以作为其他碱性金属盐或碱土盐而使用，并且主要作为抗血栓和抗凝血药物而应用(《主要动静脉血栓栓塞抗凝治疗》TranHAM，GinsbergJS。《基本原则和临床实践》ColmanRW，MarderVJ，ClowesAW，GeorgeJN，GoldhaberSZ(Ed)，LippincottWilliams和Wilkins；2006：1673-1688)。根据分子量，肝素可分为普通肝素(HNF)、低分子量肝素(HBPM)和极低分子量肝素(HMBPM)。HBPM和HMBPM通过HNF原分子的解聚获得。如在其他类型肝素中出现的一样，HBPM的抗血栓作用需要抗凝血酶III(ATIII)。通过特定的糖胺序列，肝素与抗凝血酶相连，形成HBPM-ATIII-Xa因子三元复合物。该抑制作用也称为抗血栓作用。相反的，在抗凝血作用中，凝血酶中和需要HBPM-ATIII-IIa因子三元复合物的形成，为此，至少需要18种糖类。HBPM中肝素钠的改进很大程度上是因为与抗凝血作用相比，抗血栓作用中ATIII的活性较强。另一方面，在普通肝素以及通过解聚方法获得的多种HBPM或HMBPM(酶、亚硝酸、β消除等)中，存在能够让我们通过具体的双糖单位成分量化法确定多糖量的方法，即结合到N-磺基-3-O-磺基-D-葡糖胺(ANS，3S)中的D-葡糖醛酸(G)。该方法可获得肝素结构中双糖占比与多糖成分间的比例关系，即确定相关肝素的抗FXa活性(低分子量肝素：二维核磁共振光谱结构分化。GuerriniM，GuglieriS，NaggiA，SasisekharamR和TorriG。血栓与止血学术研讨会2007；33：478-487)。在现有技术中已经记录了多种HBPM制备方法。在EP01955436专利文件中描述了通过涵盖肝素-苯索氯胺盐中肝素盐盐化、肝素-苄索氯铵盐盐化、肝素苄酯钠盐提纯和获取、苄索氯铵盐中肝素钠盐化、有机介质中的强碱解聚、苄酯皂化以及产物提纯(若有需要的话)阶段的工艺获取HBPM的过程。在本专利技术中生成相应的季铵盐肝素来取代需要事先形成的肝素苄酯中间体，季铵盐肝素提取物可作为基体。本专利技术中所描述的工艺是最简单的，可省略制备肝素苄酯中间体的步骤，既节省费用也节约了生产时间。EP1070503专利文件描述了具备以下特性的低分子量肝素获取工艺，平均分子量：2000-4000D，抗FXa活性：100-150UI/mg，抗FIIa活性小于或等于10UI/mg。通过以非水性介质为基体的苄索肝素处理获得HBPM的具体步骤为：肝素-苯索氯胺盐中肝素钠盐化、以有机介质为基础的初级解聚、苄酯钠盐盐化、初级解聚后获得的中间体苄酯钠盐形成、以有机介质为基础的二级解聚、苄酯钠盐盐化和最后的提纯。除非所形成的盐是苯索肝素盐，否则在ES2003197专利文件中也将描述此前EP1070503专利文件中所建议的相同工艺。本工艺所使用的基体为TritonB-氢氧化四烃铵，在文件中讲述到可使用任何氢氧化四烃铵化物，但没有教授如何在本工艺中影响基体并且解释在使用任何氢氧化四烃铵时，该物质不是具有决定性的元素。同时，通过对现有技术的了解，在该行业中具备较大的兴趣开发HBPM和HMBPM制备的有效工艺，该工艺可获得最大的ATIII糖胺序列，并且省略掉肝素-苄索氯铵盐盐化、苄索氯铵盐中肝素钠盐化以及苄酯皂化阶段。
技术实现思路
专利技术者已经发现了一个高收益和高选择性的HBPM和HMBPM获取新工艺，从而获得最具选择性的制备过程。此外，与其他熟知的工艺相比，所专利技术的工艺是最简单的。专利技术人员已经证实在通过β消除机制进行的HBPM和HMBPM半合成工艺中，苯索肝素盐解聚提取物的专门作用为强碱作用，可以阻止ATIII活性糖胺的保留，因为在其结构中糖胺呈现为三硫酸单糖，与含有较低硫化度单糖的其他分子破裂结构相比，更能阻碍活性糖胺的保留。工艺的特点是第一阶段为盐化(即一种盐转化为另一种盐的反应)、使用磷基或胍基进行的解聚以及最终的盐化。因此，专利技术的第一阶段指的是涵盖以下阶段的专利技术成分获取工艺：a)苯索肝素盐中碱性金属肝素钠或碱土肝素钠的盐化b)添加磷基或胍基的有机介质解聚；以及c)形成碱性金属盐或碱土盐的盐化附图说明以一组专利技术样例(但不仅限于此)的图片、插图描述本文件。图1：使用TritonB解聚的样本4中所述产物的13C-1HHSQC光谱异头信号区域(H1-C1关系)展现，在氘化水(D2O)中记录为298K。在光谱中我们可以观察到组成糖胺的5个单糖的相关5个关系峰值。ANSred、还原末端的N-磺基-D-葡糖胺；I2S、2-O硫酸化的L-艾杜糖醛苷；ANS、3S、3-O-硫酸化的D-氨基葡萄糖；G-(ANS，3S)、来自ANS、3S和ANS-(G)的D-葡糖醛酸、来自D-葡糖醛酸环的N-磺基-D-葡糖胺。画圈突显G-(ANS，3S)单元的H1-C1关系峰值，因为这是最具糖胺特点的信号，并且可视为参考以便在多个样本中确定该信号出现的数量。图2：使用BEMP解聚的样本4中所述产物的13C-1HHSQC光谱异头信号区域(H1-C1关系)展现，在氘化水(D2O)中记录为298K。在光谱中我们可以观察到组成糖胺的5个单糖的相关5个关系峰值。ANSred、还原末端的N-磺基-D-葡糖胺；I2S、2-O硫酸化的L-艾杜糖醛苷；ANS、3S、3-O-硫酸化的D-氨基葡萄糖；G-(ANS，3S)、来自ANS、3S和ANS-(G)的D-葡糖醛酸、来自D-葡糖醛酸环的N-磺基-D-葡糖胺。画圈突显G-(ANS，3S)单元的H1-C1关系峰值，因为这是最具糖胺特点的信号，并且可视为参考以便在多个样本中确定该信号出现的数量。具体实施方式在本专利技术中，“磷基或胍基”术语指的是强亲核性中性基团，如P1-t-Bu，P2-t-Bu，t-BuP4和BEMP(2-叔-丁基亚氨基-2-二乙胺基-1，3-二甲基全氢-1，3，2-二吖磷英)和TTMG(2-叔-丁基-1，1，3，3-四甲基胍)，非介子溶剂中的强碱(MeCNpKaBEMP＝27.6，DMSOpKat-BuP4H+＝32)。如上所述，专利技术的第一方面指的是涵盖以下阶段的HMBPM和/或HBPM成分获取工艺：a)苯索肝素盐中碱性金属肝素钠或碱土肝素钠的盐化b)添加磷基或胍基的有机介质解聚；以及c)形成碱性金属盐或碱土盐的盐化最终产物需要在阶段本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于获得HMBPM和/或HBPM的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：a)碱金属或碱土金属的肝素向苯甲烃铵肝素盐的盐交换；b)通过添加磷腈碱或由胍衍生的碱在有机介质中的解聚；以及c)形成碱金属或碱土金属的盐的盐交换，并且其中在步骤b)与步骤c)之间，用过氧化氢处理在步骤b)中获得的产物。

【技术特征摘要】
2012.08.02 ES P2012312571.用于获得HMBPM和/或HBPM的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：a)碱金属或碱土金属的肝素向苯甲烃铵肝素盐的盐交换；b)通过添加磷腈碱或由胍衍生的碱在有机介质中的解聚；以及c)形成碱金属或碱土金属的盐的盐交换，并且其中在步骤b)与步骤c)之间，用过氧化氢处理在步骤b)中获得的产物。2.根据权利要求1所述的方法，其中将在步骤c)之后获得的所述产物纯化。3.根据权利要求2所述的方法，其中通过将在步骤c)之后获得的产物以7.5％w/v-12.5％w/v的浓度溶解于水中，将pH调节至6.5和7.25之间的值，加入氯化钠至浓度为5％w/v-10％w/v并且使用甲醇沉淀。4.根据权利要求1-...

【专利技术属性】
技术研发人员：古伊莱莫·弗兰科罗德里格斯，伊本·古蒂耶罗阿杜里斯，
申请(专利权)人：罗维药品实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：西班牙,ES