一种N端特异的人DNA错配修复蛋白MLH1多肽及其抗体制备方法技术

本发明专利技术公开了一种N端特异的人DNA错配修复蛋白MLH1多肽及其抗体的制备方法，属于以抗体为特征的体外试验用的生物制品。N端特异的人MLH1多肽的氨基酸序列为：EVIQRPANAIKEMIE。抗人MLH1多肽抗体按以下方法制备：(1)人MLH1抗原表位的分析；(2)人MLH1 N端多肽的合成；(3)合成多肽与载体蛋白交联；(4)制备兔抗人MLH1多肽抗体；(5)收集、分离得到含有抗体的血清，纯化抗体，即得到抗人MLH1多肽抗体。本发明专利技术制备的N端特异的抗人MLH1合成多肽抗体效价高、亲和力强、特异性好，可与天然人MLH1发生特异性结合反应；制备成本低；纯化后的抗体可完全用于免疫印迹和酶联免疫吸附实验，以及建立体外免疫分析方法。该抗体为研究人MLH1的生物学功能及其与相关疾病的关系提供了较为有用的工具。

【技术实现步骤摘要】
一种N端特异的人DNA错配修复蛋白MLH1多肽及其抗体制备方法
本专利技术涉及以抗体为特征的体外试验用的生物制品，具体是一种N端特异的人DNA错配修复蛋白MLH1多肽及其抗体制备方法，属于生物医学

技术介绍
MLH1(MutLproteinhomolog1)是一种DNA错配修复蛋白。错配DNA的修复是维持不同时相遗传信息完整性的必须环节。DNA复制过程中链间错配而滑落会造成一个微小重复的改变，这被称为微卫星不稳定性。目前已有研究将这种DNA修复功能的缺陷和人类的致癌作用联系在一起。随着遗传性非息肉直肠癌(HNPCC)遗传基础的阐明，错配修复基因的重要性越来越来明显。MSHS2参与复制错配修复过程中错配核苷酸的起始识别过程，研究表明，当MSH2与错配的DNA二聚体结合后，即与MLH1和PMSH形成的异源二聚体相连，三者一同辅助错配修复的后期步骤。
技术实现思路
本专利技术是为解决通过免疫实验特异性检测人DNA错配修复蛋白MLH1的表达与天然存在，并建立相应体外免疫分析所需基本生物制品的问题，而提供的一种能特异性针对人MLH1的N端的合成多肽、相应抗体及其制备方法。本专利技术还可同时解决目前使用的类似抗体价格高，亲和力低，抗体结合蛋白的位置不特异且抗原性较差等问题。本专利技术所述的抗人MLH1合成多肽、相应抗体，按照以下步骤制备：抗原表位分析与拮抗位置确定：利用多种表位预测软件，如DNAstar，OMIGA，UWGCG等进行综合分析，主要考量指标包括亲水性结构、抗原指数、表面可及性等，再结合我们已有实际制备抗体的验证经验，最终确定第23到第37位为该抗体的靶标，其氨基酸序列为EVIQRPANAIKEMIE。多肽的合成：靶标多肽采用全自动多通道多肽合成仪合成，柱层析纯化，然后通过HPLC，用每分钟1％的标准乙晴梯度来检测纯度。多肽与载体蛋白交联：由于本合成多肽分子量太小，在动物体内不能诱导产生免疫反应，因此将多肽与载体蛋白交联后才能进行免疫，选择钥孔嘁血蓝素进行交联，能显著增加抗原的大小和免疫原性，从而制备出人工免疫原。免疫动物：所述的制备方法，其抗原肽-交联载体蛋白做为免疫原，免疫家兔制备抗体。选取适龄免疫用新西兰兔，经过适应性饲养后进行多点注射免疫。反复加强免疫，至取血测抗体效价达到标准时停止免疫。抗体纯化：达到要求的免疫动物放血，标准方法收集抗血清，依次使用辛酸-硫酸铵方法和亲和层析过柱纯化方法，进行抗血清纯化，通过SDS-PAGE和HPLC验证纯度，得到目标抗体。本专利技术制备的高质量多肽抗体效价高、亲和力强，可与天然人MLH1分子发生特异性结合反应。用多肽制备抗体的成本较常规的重组抗原制备抗体方法低，抗体特异性好，经亲和层析纯化后可以用于各种酶免检测和WB试验要求，可用于建立体外免疫分析。附图说明图1是液相色谱鉴定合成多肽纯度结果图。图2是质谱鉴定合成多肽分子量结果图。图3是通过间接ELISA方法鉴定纯化抗体相对亲和常数结果图。图1表明经过HPLC对合成的多肽进行纯化后，液相色谱鉴定纯度为98.45％。图2表明多肽分子量理论值为1741.04，质谱鉴定实测值【M+H+】为1742.92。图3中ELISA检测制备的多抗和多肽抗原亲和常数为109-1010L/mol。具体实施方式实施例1：人MLH1抗原肽的合成。用DNAstar，OMIGA，UWGCG等蛋白分析软件，对MLH1氨基酸序列进行亲水性结构(hydrophilicity)、抗原指数(antigenicity)、表面可及性(surfaceprobability)以及同源性(homology)等分析，再结合我们已有实际制备抗体的验证经验，最终确定第23到第37位为靶标，其氨基酸序列为EVIQRPANAIKEMIE。在全自动多肽合成仪上由固定羧基向氨基端递减合成后获得粗品。经30％乙睛溶解后，进行高压液相色谱(HPLC)分析，计算主峰面积并收集，经冷冻真空抽干后纯化合成肽，质谱鉴定。实施例2：合成多肽与载体的偶联。载体蛋白选择KLH(Keyholelimpethemocyanin)，用双功能试剂顺丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯(MBS)连接法将KLH与合成肽进行偶联：取KLH5mg(0.11μmol，含赖氨酸2.2μmol)，溶于0.75ml偶联缓冲液1(50mmol/L硼酸盐缓冲液，pH8.5)；3mgMBS(11μmo)溶于75μl二甲酰胺(DMF)。将MBS溶液分3次加入KLH溶液，旋转混匀，室温下作用30分钟。迅速离心后，将反应混合物(约0.8ml)加入预先用偶联缓冲液2(0.1mol/L磷酸盐，0.15mol/LNaCL，0.01mol/LNa2EDTA，pH7.0)平衡的PD-10柱。用偶联缓冲液2洗脱，收集洗脱液(即MBS-KLH溶液)。溶解1.5mg合成多肽于0.15ml偶联缓冲液2，加入MBS-KLH缓冲液0.56，室温下旋转混合，作用2小时后置4℃过夜，将反应混合物(约0.7ml)加入预先用磷酸缓冲液平衡的PD-10柱，磷酸缓冲液洗脱，收集流出液。将KLH、MBS-KLH和偶联物进行SDS-KLH和偶联物进行SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)鉴定偶联效率。实施例3：抗多肽抗体的制备。取偶联的KLH-多肽500μg，溶于500μl磷酸缓冲液，加等体积的完全福氏佐剂。免疫选取适龄免疫用新西兰兔(体重标准为2-2.5公斤)，经过适应性饲养后，背部皮内不少于15点注射。2周后抗原量减半(250μg)，加等体积的不完全福氏佐剂，第一次加强免疫。2周后进行第二次加强免疫，方法同前。再2周后开始耳缘静脉少量采血，用合成多肽(1μg/ml)包被酶标板，间接ELISA法检测免疫血清效价。反复加强免疫，至取血测抗体效价达到1∶16万时停止免疫，采用颈动脉放血收集抗体。实施例4：亲和层析纯化抗多肽抗体。①MLH1合成多肽亲和层析柱的制备：称取1.5gCNBr活化Sepharose4B，用1mmol/L盐酸充分浸洗膨胀凝胶后，再用偶联缓冲液洗2次，迅速与溶于5ml偶联缓冲液的合成多肽500μg混合，室温下旋转混合2小时。加入0.2mol/L甘氨酸4ml终止反应，室温下旋转混合1小时。用偶联缓冲液和甘氨酸缓冲液交替洗凝胶各2次，再用50ml磷酸盐缓冲液洗凝胶，按终止浓度0.02％加叠氮钠(NaN3)，置4℃保存。②亲和层析纯化抗多肽抗体：将20ml兔抗多肽血清与1.6ml多肽偶联的Sepharose4B共同加入50ml离心管，4℃旋转混合6小时。将凝胶加入层析柱，弃去流出液，用15ml磷酸盐缓冲液冲洗凝胶。每次加0.8mlpH＝2.9，0.1mol/L甘氨酸缓冲液洗脱，共8次，洗脱液分别加入8支预先加入80μl2mol/LTris-HCL缓冲液(pH7.5)，20ml磷酸盐缓冲液洗凝胶。上述全部操作过程在4℃下完成。每管取洗脱液2μl，稀释50倍后测280nm的OD值，计算蛋白质含量并绘制洗脱曲线。实施例5：抗体鉴定，使用间接ELISA方法检测抗体相对亲和常数。用合成肽交联BSA，分别以5μg/mL和10μg/mL的浓度，在4度下包被ELISA检测板过夜，10％的山羊血清室温封闭2小时后加入倍比稀释的已知蛋白浓度的纯化后的抗体，再加入HRP标记的羊抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种N端特异的人DNA错配修复蛋白MLH1多肽，其特征在于多肽的氨基酸序列为：EVIQRPANAIKEMIE。

【技术特征摘要】
1.一种N端特异的人DNA错配修复蛋白MLH1多肽，其特征在于多肽的氨基酸序列为：EVIQRPANAIKEMIE。2.一种特异的抗人DNA错配修复蛋白MLH1N端合成多肽抗体，其特征在于该抗体效价在1∶100万以上，特异性强，亲和力高达109-1010L/mol。3.一种特异的抗人DNA错配修复蛋白MLH1N端合成多肽抗体的制备方法，其特征在于以人MLH1氨基酸序列中第23到第37位的EVIQRPANAIKEMIE肽段序列作为抗原肽合成人MLH1抗原肽；纯化的抗原肽与蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈光宇，
申请(专利权)人：南京瑞姆生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32