检测木糖氧化无色杆菌的成套试剂制造技术

本发明专利技术公开了检测木糖氧化无色杆菌的成套试剂。本发明专利技术公开的检测木糖氧化无色杆菌的成套试剂由检测木糖氧化无色杆菌的引物对和探针组成；引物对由名称分别为F和R的单链DNA组成；F为序列表的序列1所示的单链DNA分子；R为序列表的序列2所示的单链DNA分子；探针的序列为序列表的序列3。实验证明，本发明专利技术的检测木糖氧化无色杆菌的成套试剂在检测木糖氧化无色杆菌时，具有高特异性，高灵敏度以及很好的重复性与扩增效率，检测木糖氧化无色杆菌简便、快速、准确，可以用来检测木糖氧化无色杆菌和制备检测木糖氧化无色杆菌的试剂。

【技术实现步骤摘要】
检测木糖氧化无色杆菌的成套试剂
本专利技术涉及生物
中，检测木糖氧化无色杆菌的成套试剂。
技术介绍
木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)属于革兰氏阴性菌。该菌为机会致病菌，通常情况下，人类对致病性木糖氧化无色杆菌有一定的天然免疫力。当皮肤粘膜受创伤后，或在人体免疫系统平衡缺失时，可能导致病人发生严重感染，如血流感染等。血流感染(bloodstreaminfections，BSI)是指一种或多种病原微生物侵入机体血液循环，在血液中释放毒素，生长繁殖并释放代谢产物，引起的全身炎症反应综合征(systemicinflammatoryresponsesyndrome，SIRS)。随着基因组学和蛋白质组学的发展，应用于临床实验室血流感染检测的分子生物学技术日益增多，如聚合酶链式反应，质谱，基因芯片，高通量测序等。实时荧光定量PCR中的TaqManMGB探针法，属于聚合酶链式反应。TaqManMGB探针法能否实现针对木糖氧化无色杆菌感染的全血样本中，木糖氧化无色杆菌病原体的直接检测的关键，是能否设计一套灵敏度高，特异性好的引物探针，目前，国内外文献报道中尚未有相关MGB探针的报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何检测木糖氧化无色杆菌。本专利技术首先提供了用于检测或辅助检测木糖氧化无色杆菌的成套试剂，所述成套试剂由检测或辅助检测木糖氧化无色杆菌的引物对和探针组成；所述引物对由名称分别为F和R的单链DNA组成；所述F为如下(b1)或(b2)；(b1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(b2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述R为如下(b3)或(b4)；(b3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(b4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；所述探针的序列为如下(b5)或(b6)；(b5)序列表的序列3；(b6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的序列。所述一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加具体可为1-5个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加。所述探针可由荧光基团和非荧光淬灭基团修饰。所述荧光基团可为FAM荧光基团，所述非荧光淬灭基团可为NFQ-MGB。所述荧光基团和所述非荧光淬灭基团可位于所述探针的两端。在本专利技术的一个实施例中，所述荧光基团修饰在所述探针的5′端，所述非荧光淬灭基团修饰在所述探针的3′端。所述引物对的两条单链DNA可独立包装，这两条单链DNA的摩尔比可为1:1。所述成套试剂中的各单链DNA和探针均可独立包装。所述成套试剂中所述引物对的两条单链DNA和所述探针的摩尔比可为1：1：1。本专利技术还保护所述检测或辅助检测木糖氧化无色杆菌的引物对。本专利技术还保护含有所述成套试剂或所述引物对的系统；所述系统的用途为如下(e1)或(e2)：(e1)检测待测菌是否为木糖氧化无色杆菌；(e2)检测待测样本中是否含木糖氧化无色杆菌。所述系统还可包括利用定量PCR检测木糖氧化无色杆菌所需要的其他试剂和/或仪器。所述利用定量PCR检测木糖氧化无色杆菌所需要的其他试剂具体可为SuperscriptIIIplatinumonestepqRT-PCR试剂盒中的试剂，如2×ReactionMix、SuperscriptIIIplatinumTaqMix和/或ROXreferencedye。所述利用定量PCR检测木糖氧化无色杆菌所需要的仪器具体可为ViiATM7Real-TimePCRSystem。具体来说，所述系统可仅由所述成套试剂或所述引物对组成，也可由所述成套试剂或所述引物对与所述利用定量PCR检测木糖氧化无色杆菌所需要的其他试剂和/或仪器组成。所述系统可为仅包括相关试剂的试剂盒。本专利技术还保护所述成套试剂或所述引物对在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(e1)或(e2)：(e1)检测待测菌是否为木糖氧化无色杆菌；(e2)检测待测样本中是否含木糖氧化无色杆菌。本专利技术还保护所述成套试剂的制备方法，所述方法包括将所述引物对的两条单链DNA和所述探针分别独立包装。本专利技术还保护所述引物对的制备方法，所述方法包括将所述引物对的两条单链DNA分别独立包装。本专利技术还保护所述成套试剂在检测或辅助检测木糖氧化无色杆菌中的应用。本专利技术还保护所述引物对在检测或辅助检测木糖氧化无色杆菌中的应用。利用所述成套试剂在检测待测样品时，如反应体系中出现扩增曲线，所述待测样品为或候选为木糖氧化无色杆菌或所述待测样品含有或候选含有木糖氧化无色杆菌；如反应体系中无扩增曲线，所述待测样品不为或候选不为木糖氧化无色杆菌或所述待测样品不含有或候选不含有木糖氧化无色杆菌。实验证明，本专利技术的检测木糖氧化无色杆菌的成套试剂在检测木糖氧化无色杆菌时，具有高特异性，高灵敏度以及很好的重复性与扩增效率，检测木糖氧化无色杆菌简便、快速、准确，可以用来检测木糖氧化无色杆菌和制备检测木糖氧化无色杆菌的试剂。附图说明图1为实施例1的成套试剂的特异性检测。1-23表示10种革兰氏阳性菌(无乳链球菌，溶血葡萄球菌，金黄色葡萄球菌，化脓性链球菌，肺炎链球菌，单增李斯特菌，产气荚膜梭菌，表皮葡萄球菌，屎肠球菌，粪肠球菌)，8种革兰氏阴性菌(大肠杆菌，产酸克雷伯菌，铜绿假单胞菌，肺炎克雷伯菌，黏质沙雷氏菌，鲍曼不动杆菌，嗜麦芽窄食单胞菌，洋葱伯克霍尔德菌)，4种真菌(白色念珠菌，光滑念珠菌，新型隐球菌，近平滑念珠菌)以及阴性对照。图2为实施例1的成套试剂的灵敏度检测。图3为实施例4的标准曲线。横坐标为菌的浓度，单位为cfu/mL。图4为对应于图3的各点的扩增曲线。图5为批间标准曲线。图6为第一次重复实验的批内标准曲线。图7为第二次重复实验的批内标准曲线。图8为第三次重复实验的批内标准曲线。图9为成套试剂甲的检测结果。图10为成套试剂乙的检测结果。图11为成套试剂丙的检测结果。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本专利技术，而不是为了限制本专利技术的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1、检测木糖氧化无色杆菌的成套试剂的制备检测木糖氧化无色杆菌的成套试剂由检测或辅助检测木糖氧化无色杆菌的引物对和探针P组成；该引物对由名称分别为F和R的单链DNA组成；F为序列表的序列1所示的单链DNA分子；R为序列表的序列2所示的单链DNA分子；探针P的序列为序列表的序列3，该探针的5′端标记有FAM荧光基团，3′端标记有非荧光淬灭基团NFQ-MGB。序列1-序列3的第1位均为相应序列的5′端核苷酸。检测木糖氧化无色杆菌的成套试剂的各单链DNA和探针分别独立包装，引物对中的两条单链DNA的摩尔比为1:1。实施例2、检测木糖氧化无色杆菌的成套试剂的特异性一、待测菌株所用菌株为如下23株菌：10种革兰氏阳性菌(无乳链球菌，溶血葡萄球菌(舒小莉；吴亦栋；尚世强,细菌16SrRNA基因实时荧光定量及分型方法的建立.中国当本文档来自技高网...

【技术保护点】
成套试剂，由检测或辅助检测木糖氧化无色杆菌的引物对和探针组成；所述引物对由名称分别为F和R的单链DNA组成；所述F为如下(b1)或(b2)；(b1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(b2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述R为如下(b3)或(b4)；(b3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(b4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；所述探针的序列为如下(b5)或(b6)；(b5)序列表的序列3；(b6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的序列。

【技术特征摘要】
1.成套试剂，由检测或辅助检测木糖氧化无色杆菌的引物对和探针组成；所述引物对由名称分别为F和R的单链DNA组成；所述F为如下(b1)或(b2)；(b1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(b2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述R为如下(b3)或(b4)；(b3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(b4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；所述探针的序列为如下(b5)或(b6)；(b5)序列表的序列3；(b6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的序列。2.根据权利要求1所述的成套试剂，其特征在于：所述探针由荧光基团和非荧光淬灭基团修饰。3.权利要求1中所述的检测木糖氧化无色杆菌的引物对。4.含有权利要求1或2所述成套试...

【专利技术属性】
技术研发人员：江华，姜永强，张超，郑玉玲，郑新，刘鹏，赵成娜，孔德聪，律清宇，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11