本发明专利技术公开了一种嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细胞的制备方法、制得的CAR‑T细胞及其用途，包括以下步骤：S1、将分离得到的CD4+T细胞与CD8+T细胞激活；S2、用携带EGFR‑CAR的重组慢病毒感染上述步骤S1处理后的CD4+T细胞和CD8+T细胞，将感染处理后得到的EGFR‑CAR CD4+T细胞和EGFR‑CAR CD8+T细胞共同培养，以促进EGFR‑CAR CD8+T细胞增殖。与现有技术相比，将EGFR‑CAR CD4+T细胞与EGFR‑CAR CD8+T细胞共培养，可使得EGFR‑CAR CD8+T细胞的增殖率提高2倍以上，制得的CAR‑T细胞具有广泛的应用前景，且具有良好的杀瘤效果。
【技术实现步骤摘要】
一种嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细胞的制备方法、制得的CAR-T细胞及其用途
本专利技术涉及细胞免疫学领域，具体涉及一种嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细胞(ChimericAntigenReceptorT-Cell，CAR-T细胞)的制备方法、制得的CAR-T细胞及其用途。
技术介绍
T淋巴细胞简称T细胞，是机体免疫系统内功能最重要的细胞群之一，维持着机体正常的免疫功能，按细胞表面标识分子的不同，T细胞可分为CD4+和CD8+亚群。根据T细胞所处的活化阶段，T细胞可分为初始T细胞(TN)、效应T细胞(TEM)和记忆性T细胞(TCM)。初始CD4+T细胞接受抗原刺激后又可分化为Th1细胞、Th2细胞、Th3细胞，其中Th1细胞可通过分泌IL-2和IFN-γ刺激细胞毒性CD8+T细胞(CD8+CTL)的增殖和分化，CTL可特异性杀伤肿瘤细胞，同时还可通过分泌TNF直接诱导靶细胞凋亡。免疫治疗(Immunotherapy)是通过提高机体自身的抗肿瘤免疫能力来杀灭肿瘤细胞的一种治疗方法，具有特异性强、不良反应轻和能够长期记忆等特点，是一种较理想的治疗策略，被称为继手术、放疗和化疗之后的第四种肿瘤治疗方法。其中，嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，CAR)修饰的T淋巴细胞(CAR-T)技术是新近迅速发展的一种细胞免疫治疗技术，通过基因工程方法修饰T淋巴细胞，该方法能够克服肿瘤局部免疫抑制微环境和宿主免疫耐受状态，提高抗肿瘤的靶向性、杀伤活性及持久性。鉴于CAR-T技术的优势，近年来该技术发展迅猛。2017年8月31日，诺华(Novartis)公司突破性CAR-T细胞疗法Kymriah(tisagenlecleucel，曾用名CTL019)获得FDA批准上市，适应症是急性淋巴性白血病(ALL)的25岁以下患者。Kymriah成为人类历史上首款CAR-T细胞疗法。2017年10月18日，美国FDA宣布批准了KitePharma的CAR-T疗法Yescarta(axicabtageneciloleucel)上市，治疗罹患特定类型的大B细胞淋巴瘤成人患者。这是美国FDA批准的首款针对特定非霍奇金淋巴瘤的CAR-T疗法，也是人类历史上第二款获批的CAR-T疗法。尽管CAR-T技术已经有了突破性的进展，然而CAR-T技术仍存在一些瓶颈问题还未解决，如CAR-T细胞的扩增数量有限，进而限制了CAR-T细胞的杀伤效力。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：提供一种能够解决CAR-T细胞扩增受限问题的嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细胞的制备方法、制得的CAR-T细胞及其用途。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：一种嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细胞的制备方法，包括以下步骤：S1、将分离得到的CD4+T细胞与CD8+T细胞激活；S2、用携带表皮生长因子受体(Epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)-CAR的重组慢病毒感染上述步骤S1处理后的CD4+T细胞和CD8+T细胞，将得到的EGFR-CARCD4+T细胞和EGFR-CARCD8+T细胞共同培养。本专利技术的有益效果在于：将EGFR-CARCD4+T细胞与EGFR-CARCD8+T细胞共培养，可使得EGFR-CARCD8+T细胞的增殖率提高2倍以上；将得到的EGFR-CARCD4+T细胞和EGFR-CARCD8+T细胞共同培养，以促进EGFR-CARCD8+T细胞增殖。通过本专利技术方法制备的CAR-T细胞，杀瘤效果更好，本专利技术方法制得的CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤率可达90±4％。本专利技术还包括通过上述方法制得的CAR-T细胞。本专利技术还包括将上述CAR-T细胞在制备治疗或预防癌症的药物中的用途。本专利技术的有益效果在于：本专利技术CAR-T细胞应用前景广泛，将可广泛应用于多种癌症治疗且具有良好的治疗效果。具体实施方式为详细说明本专利技术的
技术实现思路
、所实现目的及效果，以下结合实施方式予以说明。本专利技术最关键的构思在于：将EGFR-CARCD4+T细胞与EGFR-CARCD8+T细胞共培养，可使得EGFR-CARCD8+T细胞的增殖率提高2倍以上。一种嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细胞的制备方法，包括以下步骤：S1、将分离得到的CD4+T细胞与CD8+T细胞激活；S2、用携带EGFR-CAR的重组慢病毒感染上述步骤S1处理后的CD4+T细胞和CD8+T细胞，将得到的EGFR-CARCD4+T细胞和EGFR-CARCD8+T细胞共同培养。从上述描述可知，本专利技术的有益效果在于：将EGFR-CARCD4+T细胞与EGFR-CARCD8+T细胞共培养，可使得EGFR-CARCD8+T细胞的增殖率提高2倍以上；将得到的EGFR-CARCD4+T细胞和EGFR-CARCD8+T细胞共同培养，以促进EGFR-CARCD8+T细胞增殖。通过本专利技术方法制备的CAR-T细胞，杀瘤效果更好，本专利技术方法制得的CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤率可达90±4％。进一步地，所述步骤S1中的激活步骤的具体操作为：向分离得到的CD4+T细胞和CD8+T细胞中添加CD3/CD28抗体偶联磁珠。进一步地，所述CD3/CD28抗体偶联磁珠与T细胞的比例为1:1～3:1，优选为3:1。从上述描述可知，本专利技术的有益效果在于：CD3/CD28抗体偶联磁珠与T细胞的比例为3:1时，激活效果更佳。进一步地，所述步骤S2还包括向EGFR-CARCD4+T细胞和EGFR-CARCD8+T细胞共培养体系添加重组人IL-2、IL-7和/或IL-15进行培养。优选地，所述步骤S2还包括向EGFR-CARCD4+T细胞和EGFR-CARCD8+T细胞共培养体系添加重组人IL-2、IL-7和IL-15进行培养。从上述描述可知，本专利技术的有益效果在于：向EGFR-CARCD4+T细胞和EGFR-CARCD8+T细胞共培养体系添加不同的细胞因子，可使EGFR-CARCD8+T细胞获得不同的扩增倍数，只添加重组人IL-2时，可扩增10倍；添加重组人IL-2和IL-7时，可扩增30倍；添加重组人IL-2和IL-15时，可扩增55倍；添加重组人IL-2、IL-7和IL-15时，可扩增100倍。进一步地，所述重组人IL-2的最终浓度为300～500IU/ml，重组人IL-7的最终浓度为5～8ng/ml，重组人IL-15的最终浓度为5～8ng/ml。优选地，所述重组人IL-2的最终浓度为300IU/ml，重组人IL-7的最终浓度为5ng/ml，重组人IL-15的最终浓度为5ng/ml。进一步地，所述CD4+T细胞的分离操作具体如下：从外周血单个核细胞中分离CD4+T细胞，采用抗-CD3、抗-CD45RA、抗-CD62L抗体，通过流式细胞术分选出CD4+T细胞，表面标记分子为CD4+CD45RA+CD62L+。进一步地，所述CD8+T细胞分离的具体操作为：从外周血单个核细胞中分离CD8+T细胞，采用抗-CD3、抗-CD45RA、抗-CD62L抗体，通过流式细胞术分选出CD8+T细胞，表面标记分子为CD8+CD45RA+CD62L+。进一步地，所述CD4+T细胞和CD8+T细胞分离所用的外周血通过以下操作进行前处理：本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细胞的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、将分离得到的CD4+T细胞与CD8+T细胞激活；S2、用携带EGFR‑CAR的重组慢病毒感染上述步骤S1处理后的CD4+T细胞和CD8+T细胞，将感染处理后得到的EGFR‑CAR CD4+T细胞和EGFR‑CARCD8+T细胞共同培养，以促进EGFR‑CAR CD8+T细胞增殖。
【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细胞的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、将分离得到的CD4+T细胞与CD8+T细胞激活；S2、用携带EGFR-CAR的重组慢病毒感染上述步骤S1处理后的CD4+T细胞和CD8+T细胞，将感染处理后得到的EGFR-CARCD4+T细胞和EGFR-CARCD8+T细胞共同培养，以促进EGFR-CARCD8+T细胞增殖。2.根据权利要求1所述的制备CAR-T细胞的方法，其特征在于：所述步骤S1中的激活步骤的具体操作为：向分离得到的CD4+T细胞和CD8+T细胞添加CD3/CD28抗体偶联磁珠。3.根据权利要求2所述的制备CAR-T细胞的方法，其特征在于：所述CD3/CD28抗体偶联磁珠与T细胞的比例为1:1～3:1。4.根据权利要求1所述的制备CAR-T细胞的方法，其特征在于：所述步骤S2还包括向EGFR-CARCD4+T细胞和EGFR-CARCD8+T细胞共培养体系添加重组人IL-2、IL-7和IL-15进行培...
【专利技术属性】
技术研发人员：姜舒，张芸，纪惜銮，郑思建，杨顺，罗朝霞，
申请(专利权)人：深圳市茵冠生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44
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