一种基于数据依赖性质谱扫描模式的谱图库建立方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种基于数据依赖性质谱扫描模式的谱图库建立方法，及其在基于所有理论碎片离子连续窗口采集(SWATH)技术的组蛋白和翻译后修饰的多重无标记的相对定量。在数据库建立阶段，人为依据质核比不同将母离子在气象分成若干连续级分，采用无动态排除的数据依赖性质谱扫描模式，对样品中所有的母离子进行有效碎裂和信息采集。在基于SWATH的定量阶段，通过超高速扫描获得扫描范围内全部母离子的碎片信息，将这些信息与上述谱图库中的数据进行比对，获得高准确度和高覆盖度的蛋白质多重定量数据。本发明专利技术能用于组蛋白及其翻译后修饰的多重无标记相对定量，实现对其在生物学过程中变化的动态监控。

【技术实现步骤摘要】
一种基于数据依赖性质谱扫描模式的谱图库建立方法及其应用
一种基于数据依赖性质谱扫描模式的谱图库建立方法，及其在基于所有理论碎片离子连续窗口采集(SWATH)技术的组蛋白和翻译后修饰多重无标记相对定量中的应用，从而实现在生物学过程中对组蛋白及其翻译后修饰变化的动态监控。
技术介绍
以细胞培养稳定同位素标记氨基酸的技术(SILAC)为代表的体内代谢标记技术是目前组蛋白翻译后修饰蛋白质组学定量中使用最广泛的一种技术(Nat.Methods.2004，1(2)，119-26)。然而体内代谢标记技术受限于氨基酸的元素种类，通常只可用于2-3个样品之间的相对定量(Nat.Methods.2013，10(4)，332-4)。由于组蛋白N端赖氨酸上的翻译后修饰类型和位点较丰富，因此常用的体外化学标记方法，如TMT、iTRAQ和DiLeu等，不能对酶解后组蛋白N端赖氨酸ε-氨基进行有效标记，从而难以实现组蛋白动态翻译后修饰的准确定量。目前采用无标记定量技术，包括选择反应监控(SRM)、多反应监控(MRM)、平行反应监控(PRM)和数据非依赖采集模式(DIA)等，可实现对组蛋白翻译后修饰进行定量分析。但是上述无标记定量方法均是针对目标肽段及蛋白的定量，无法对组蛋白翻译后修饰进行规模化定量分析。基于DIA模式的理论谱图的连续窗口采集(SWATH)技术，可以将所有母离子分为25m/z的窗口进行碎裂，提取目标母离子的碎片离子进行定量，已经被应用在组蛋白H3的翻译后修饰定量分析中(Mol.Cell.Proteomics.2015，14(9)，2420-8)。谱图库的建立对于SWATH定量至关重要，然而传统的DDA建库方式在进行组蛋白翻译后修饰研究中存在高丰度非翻译后修饰肽段抑制低丰度翻译后修饰肽段的质谱采集效率的问题，会造成翻译后修饰鉴定信息的丢失，从而导致组蛋白翻译后修饰的定量分析准确度和覆盖度低。因此，建立高准确度、高覆盖度的多重定量方法，对于实现生物学过程中组蛋白翻译后修饰全面、精确的定量分析非常关键。
技术实现思路
本专利技术发展了一种基于数据依赖性质谱扫描模式的谱图库建立方法，还提供了该谱图库建立方法用于基于所有理论碎片离子连续窗口采集(SWATH)技术的组蛋白及其翻译后修饰的多重无标记相对定量，实现了组蛋白及其翻译后修饰高准确度、高覆盖度的多重定量，对于实现生物学过程中组蛋白翻译后修饰全面、精确的定量分析非常关键。本专利技术的技术方案为：一种基于数据依赖性质谱扫描模式的谱图库建立方法：1)在数据库建立阶段，人为依据质荷比不同将母离子在气象分成M个连续级分，每个级分为一个窗口，每个窗口的质荷比范围相等或不等，对每个级分单独扫描得到一级谱图；2)在无动态排除的数据依赖性质谱扫描模式下，将每个级分中强度排在前N的母离子分别进行二级碎裂，此时相当于一共进行了M*N个二级质谱扫描,获得扫描范围内全部母离子的碎片信息。一级扫描母离子的质谱采集的质荷比窗口为250-6500m/z范围内的任意区间。依据质荷比不同将母离子在气象分成连续级分时，将母离子质谱采集的质荷比窗口分为连续窗口，每个窗口大小为质荷比3m/z-1500m/z。质谱扫描所采用的是飞行时间质谱仪,且该飞行时间质谱仪的扫描速度能够达到一秒15张谱图及一秒15张谱图以上。步骤1)中M为2-100中的任意整数，N为20-100中的任意整数。通过超高速扫描时质谱检测所采用的质谱仪为飞行时间质谱仪(该飞行时间质谱仪的扫描速度能够达到一秒15张谱图及一秒15张谱图以上)。飞行时间质谱仪包括ABSciex公司的TripleTOF4600、TripleTOF5600、TripleTOF6600等。本专利技术还提供上述谱图库建立方法于蛋白质及其翻译后修饰的多重无标记相对定量中的应用。提供一种方案为:所述蛋白质为组蛋白，基于SWATH的组蛋白及其翻译后修饰多重无标记定量操作方法具体为：a:将一部分纯化的不同对比组的组蛋白混合，进入质谱进行权利要求1中步骤1)和2)所述的谱图库建立阶段；b:将另一部分未混合的纯化的不同对比组的组蛋白分别进入质谱进行SWATH定量；c:在基于SWATH的定量阶段，通过超高速扫描获得扫描范围内全部母离子的碎片信息，将这些信息与1)中建立的谱图库中的数据进行比对，通过提取此阶段中母离子的A个子离子的峰面积，取加和或平均后获得母离子的定量数据。步骤c中A为2-30中的任意整数。步骤c所述的SWATH定量阶段采用如下两种方法中的一种:将整个质谱采集窗口划分为相隔25Da的扫描区间，同时碎裂每一个扫描区间内的所有母离子，得到混合的碎片离子谱图，将这些谱图与谱图库进行比对，用碎片离子色谱峰面积进行相对定量；或者，依据待测样品在整个质谱采集窗口中的丰度分布情况将质谱采集窗口划分为间隔可变的多个(20-35个)扫描区间，同时碎裂每一个扫描区间内的所有母离子，得到混合的碎片离子谱图，将这些谱图与谱图库进行比对，用碎片离子色谱峰面积进行相对定量。所述组蛋白为H1、H2A、H2B、H3、H4以及H1、H2A、H2B、H3、H4变体中的一种或多种；组蛋白翻译后修饰包括发生在赖氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、组氨酸、谷氨酸一种或多种氨基酸上的单甲基化、二甲基化、三甲基化、甲酰化、乙酰化、丙酰化、丁酰化、巴豆酰化、丙二酰化、琥珀酰化、磷酸化、聚磷酸化、泛素化、瓜氨酸化、羟基化、ADP核糖基化、N-乙酰葡糖胺糖基化、2-羟基异丁酰化修饰一种或多种翻译后修饰；多重无标记相对定量包括2-20重样品之间的无标记相对定量；组蛋白及其翻译后修饰的变化包括组蛋白及其变体含量的变化、翻译后修饰含量与种类的变化以及发现新的组蛋白变体、翻译后修饰和翻译后修饰位点；重要的生物学过程包括疾病发展的不同时期、疾病在不同的器官和组织中的分布、疾病在相同器官或组织中不同部位的分布、生物体受外界刺激(外界刺激包括：激素刺激、生长因子刺激、温度刺激、光刺激、电刺激、无机小分子物质刺激)所产生应激反应。本专利技术的优点：1)建立了高准确度、高覆盖度的多重定量方法，实现了生物学过程中组蛋白翻译后修饰全面、精确的定量分析。2)采用质谱气象分级策略，降低了实验过程中人为操作引起的样品损失。3)低丰度翻译后修饰肽段能够得到好的鉴定。附图说明图1为本专利技术谱图库建立方法的示意图。图2为MCF-7细胞中组蛋白酶解产物连续24针的总离子流图。图3为组蛋白以及其变体在EGF-β处理不同时间下的变化图。图4为组蛋白H3K36三甲基化修饰在EGF-β处理不同时间后的动态变化图。具体实施方式实施例1用EGF-β处理MCF-7细胞，经过0h、6h、12h、24h、36h、48h后，用NIB-250裂解液(15mMTris-HCl，pH7.5，15mMNaCl，60mMKCl，5mMMgCl2，1mMCaCl2，250mM蔗糖，0.2％NP-40，蛋白酶抑制剂)裂解细胞，经过离心除去胞浆蛋白后，沉淀用0.2N硫酸溶液提取其中的组蛋白。提取出的组蛋白进行丙酰化衍生，经过酶解后使用ABTriple-TOF5600进行质谱分析，在基于质谱快速扫描和无动态排除的模式下进行蛋白质组鉴定，这种气象分级的方式降低了常规液相分级带来的样品损失，对于低丰度肽段或者翻本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于数据依赖性质谱扫描模式的谱图库建立方法，其特征在于：1)在数据库建立阶段，人为依据质荷比不同将母离子在气象分成M个连续级分，每个级分为一个窗口，每个窗口的质荷比范围相等或不等，对每个级分单独扫描得到一级谱图；2)在无动态排除的数据依赖性质谱扫描模式下，将每个级分中强度排在前N的母离子分别进行二级碎裂，此时相当于一共进行了M*N个二级质谱扫描,获得扫描范围内全部母离子的碎片信息。

【技术特征摘要】
1.一种基于数据依赖性质谱扫描模式的谱图库建立方法，其特征在于：1)在数据库建立阶段，人为依据质荷比不同将母离子在气象分成M个连续级分，每个级分为一个窗口，每个窗口的质荷比范围相等或不等，对每个级分单独扫描得到一级谱图；2)在无动态排除的数据依赖性质谱扫描模式下，将每个级分中强度排在前N的母离子分别进行二级碎裂，此时相当于一共进行了M*N个二级质谱扫描,获得扫描范围内全部母离子的碎片信息。2.依照权利要求1所述的基于数据依赖性质谱扫描模式的谱图库建立方法，其特征在于：一级扫描母离子的质谱采集的质荷比窗口为250-6500m/z范围内的任意区间。3.依照权利要求1所述的基于数据依赖性质谱扫描模式的谱图库建立方法，其特征在于：依据质荷比不同将母离子在气象分成连续级分时，将母离子质谱采集的质荷比窗口分为连续窗口，每个窗口大小为质荷比3m/z-1500m/z。4.依照权利要求1所述的基于数据依赖性质谱扫描模式的谱图库建立方法，其特征在于：步骤1)中M为2-100中的任意整数，N为20-100中的任意整数。5.依照权利要求1所述的基于数据依赖性质谱扫描模式的谱图库建立方法，其特征在于：质谱扫描所采用的是飞行时间质谱仪,且该飞行时间质谱仪的扫描速度能够达到一秒15张谱图及一秒15张谱图以上。6.一种权利要求1-5所述任一谱图库建立方法于蛋白质及其翻译后修饰的多重无标记相对定量中的应用。7.依照权利要求6所述的应用,其特征在于:所述蛋白质为组蛋白，基于SWATH的组蛋白及其翻译后修饰多重无标记定量操作方法具体为：a:将一部分纯化的不同对比组的组蛋白混合，进入质谱进行权利要求1中步骤1)和2)所述的谱图库建立阶段；b:将另一部分未混合的纯化的不同对比组的组蛋白分别进入质谱进行SWATH定量；c:在基于SWATH的定量阶段，通过超高速...

【专利技术属性】
技术研发人员：张丽华，胡晔晨，赵群，杨开广，张玉奎，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21