人源化基因改造动物模型的制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及人源化基因的基因改造非人动物，特别是基因改造啮齿动物，但尤其是基因改造小鼠，具体涉及人源化TIM‑3基因动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。

【技术实现步骤摘要】
人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
本申请涉及人源化基因改造动物模型的建立方法及应用，具体而言，涉及基于一种人源化TIM-3基因改造动物模型的构建方法及其在生物医药的应用。
技术介绍
免疫疗法通过激活免疫系统攻击并杀死癌症细胞，是肿瘤研究的一个重要领域，近十年来已经应用在临床治疗中。研究表明，以T细胞的抑制性受体为目标进行治疗效果显著，是当前靶向基因治疗最成功的领域。其中，靶向CTLA-4和PD-1/PD-L1的单克隆抗体已经取得确切疗效，更多靶向其它的抑制性受体的新型药物正在或已经进入临床研究。T细胞免疫球蛋白及粘蛋白-3(Tcellimmunoglobulinandmucindomain-3，Tim-3)主要表达于IFN-γ分泌型CD4+Th1和CD8+Tc1细胞，其基本结构包括一个信号肽、免疫球蛋白区、黏蛋白区、跨膜区和有磷酸化位点的胞内区，在结构上属于Tim家族。通过与其天然配体半乳凝素-9(Galectin-9，Gal-9)结合，触发胞内信号通路，最终可导致T细胞功能的抑制，对细胞免疫起负性调节作用。大量研究证明TIM-3是抗肿瘤免疫中的关键负性调节剂，其表达有助于肿瘤免疫逃逸。研究发现胃癌患者外周血中TIM-3(+)T细胞群明显多于健康对照(AnincreasednumberofPD-1+andTim-3+CD8+Tcellsisinvolvedinimmuneevasioningastriccancer)，且胃癌组织中TIM-3的表达显著高于胃炎组织(IntJClinExpPathol.2015Aug1；8(8):9452-7.eCollection2015.ExpressionofTim-3ingastriccancertissueanditsrelationshipwithprognosis.ChengG)，表明TIM-3在胃癌的发生和发展中起重要作用。在乳腺癌、食道癌、结肠癌、非小细胞肺癌、肾细胞癌等多种肿瘤中，TIM-3的表达上调均提示预后不良。已有研究证实，使用TIM-3抗体可增强环磷酰胺在小鼠CT26结肠癌肿瘤模型中的治疗功效，更明显的抑制肿瘤生长(SciRep.2015Oct23；5:15659.doi:10.1038/srep15659.ApoptosisoftumorinfiltratingeffectorTIM-3+CD8+Tcellsincoloncancer.KangCW)。但有时单独阻断TIM-3途径效果有限。研究表明，几乎所有TIM-3(+)T细胞均共表达PD-1分子(AnincreasednumberofPD-1+andTim-3+CD8+Tcellsisinvolvedinimmuneevasioningastriccancer；TargetingPD-1andTim-3PathwaystoReverseCD8T-CellExhaustionandEnhanceExVivoT-CellResponsestoAutologousDendritic/TumorVaccines)，且这种双阳性T细胞表现出更严重的衰竭状态。不少研究显示联合抑制TIM-3和PD-1的效果优于单独抑制疗法。尽管对TIM-3感兴趣，但直到现在仍不了解有关TIM-3作用机制的细节，也没有上市的TIM-3抗体。因此，本领域有必要深入研究TIM-3与肿瘤免疫机制间相互影响及对肿瘤进展的综合作用，阐明TIM-3在肿瘤免疫治疗中的应用价值，加快TIM-3抗体药物的开发进程。实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和药物是不可缺少的研究工具。目前已有少数与TIM-3相关的实验动物。Sanchez-Fueyoetal.(2003)等人为了研究TIM-3在免疫应答中的负调节功能，成功制备了Tim-3缺陷小鼠(BALB/c背景)，发现该小鼠胸腺发育正常，未发现自身免疫或淋巴增生性状，且T辅助细胞功能未影响；在自身混合淋巴细胞反应中，Tim-3缺陷小鼠表现出轻微的增殖反应。但由于BALB/c小鼠免疫应答以Th2细胞为优势，Tim-3并不表达在Th2细胞表面，使用该小鼠进行的研究结果可能不够全面。JosalynL.Cho(2012)等人在小鼠7号外显子上插入Zeo片断破坏胞质区序列，成功制备了TIM-3mut小鼠(C57BL/6背景)。该小鼠同样可正常存活并无形态异常，对6-8周龄小鼠的淋巴、脾脏和肺分析发现CD4+比例与野生型并无差异，在初始CD4+或CD8+T细胞中TIM-3的表达也未显示差异。但该突变导致小鼠TIM-3末端胞质结构域缺失，TCR-CD3z链磷酸化程度降低从而下调了T细胞的活性，细胞因子(IFN-γ)表达降低，在流感病毒感染时降低了发病率和死亡率。以上研究表明现有与TIM-3相关的模式动物主要用于研究基因信号通路、功能等方面。随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类细胞或基因替代或置换动物的内源性同类细胞或基因，以建立更接近人类的生物体系或疾病模型，建立人源化实验动物模型(humanizedanimalmodel)，已经为临床上新的治疗方法或手段提供了重要工具。其中基因人源化动物模型，即，利用基因遗传操作技术，用人类正常或突变基因替换动物同类基因，可在动物体内建立更接近人类的正常或突变基因体系的基因人源化动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的存在，动物体内可表达或部分表达含有人类功能的蛋白质，从而大大减少人和动物的临床实验差异，为在动物水平进行药物筛选提供了可能。鉴于TIM-3基因在肿瘤免疫治疗领域具有巨大应用价值，为了使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本专利技术在世界范围内首次提供一种建立人源化TIM-3基因改造动物模型的新方法，并得到世界首例TIM-3基因人源化动物。具体来说，本专利技术的目的是制备一种非人动物模型，该动物体内可正常表达TIM-3蛋白，且表达的TIM-3蛋白能识别并结合人TIM-3抗体/抗原，该方法在肿瘤药物筛选等方面有着广阔的应用前景。
技术实现思路
为了解决上述问题，本申请专利技术人惊奇的发现利用创造性劳动筛选设计独特的sgRNA序列，使非人动物TIM-3基因的特定片段被人TIM-3基因特定片段替换，本申请专利技术人成果得到世界首例人源化TIM-3基因非人动物模型，特别是TIM-3基因人源化小鼠。成功制备TIM-3基因人源化的模式动物，该模型体内可正常表达TIM-3蛋白，可用于TIM-3基因功能研究、靶向TIM-3抗体的筛选和评价。利用本专利技术制备的动物模型可用于针对人TIM-3靶位点的药物筛选、药效研究，免疫相关疾病和肿瘤治疗等应用，加快新药研发过程，节约时间和成本，降低药物开发风险。对于研究TIM-3蛋白的功能和肿瘤药物筛选等提供了有力工具。同时还得到基因敲除动物模型。以及利用本模型可以与其它人源化动物模型(包括但不限于，人源化PD-1抗体动物模型)交配得到双人源动物模型，可用于联合用药情况下筛选抗体及联合用药的药效评价等。本专利技术的第一方面，提供了一种靶向载体，其包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自TIM-3基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种靶向载体，其包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自TIM‑3基因基因组DNA的100‑10000个长度的核苷酸；b)插入或替换的供体DNA序列，其编码供体转换区；和c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自TIM‑3基因基因组DNA的100‑10000个长度的核苷酸。

【技术特征摘要】
2016.11.11 CN 20161099421821.一种靶向载体，其包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自TIM-3基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；b)插入或替换的供体DNA序列，其编码供体转换区；和c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自TIM-3基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。2.根据权利要求1所述的靶向载体，其特征在于，a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000077.6至少具有90％同源性的核苷酸，优选的，所述与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自NCBI登录号为NC_000077.6的第46454902-46456260位核苷酸；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000077.6至少具有90％同源性的核苷酸，优选的，所述与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000077.6的第46456585-46457884位核苷酸。3.根据权利要求1或2所述的靶向载体，其特征在于，所述的待改变的转换区位于Tim-3基因第2号外显子。4.根据权利要求1-3任一所述的靶向载体，其特征在于，其中插入或替换的供体DNA序列来自人。优选的，所述插入或替换的供体DNA序列为人TIM-3基因的核苷酸序列部分或全部。进一步优选的，所述人TIM-3基因的核苷酸序列包括人TIM-3基因DNA序列的第1号外显子、第2号外显子、第3号外显子、第4号外显子、第5号外显子、第6号外显子和/或第7号外显子中的一个或多个。5.一种用于构建人源化动物模型的sgRNA序列，其特征在于，所述sgRNA序列靶向非人动物Tim-3基因，同时所述sgRNA在待改变的非人动物TIM-3基因上的靶序列上是唯一的，且按照5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则。优选的，所述非人动物为啮齿动物。更优选的，所述啮齿动物为小鼠。优选的，所述sgRNA在小鼠Tim-3基因的靶位点位于小鼠Tim-3基因的第2号外显子上。更优选的，sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQIDNO：1-6任一项所示，sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQIDNO：7-13任一项所示。进一步优选的，sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQIDNO：3所示，sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQIDNO：8所示。6.根据权利要求5所述的一种用于构建人源化动物模型的sgRNA序列，其特征在于，其识别5’端靶位点的sgRNA序列选自SEQIDNO：14和SEQIDNO：16、SEQIDNO：15和SEQIDNO：17；其识别3’端靶位点的sgRNA序列选自SEQIDNO：18和SEQIDNO：20、SEQIDNO：19、SEQIDNO：21。7.一种包含权利要求5-6任一所述sgRNA序列的构建体。8.一种制备sgRNA载体的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提供一种sgRNA序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列，所述sgRNA序列靶向非人动物Tim-3基因，同时所述sgRNA在待改变的非人动物Tim-3基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则；(2)合成含有T7启动子及sgRNAscaffold的片段DNA，并将所述片段DNA通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；(3)将步骤(1)获得的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤(2)所述的pT7-sgRNA载体的双链；(4)将步骤(3)中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。9.根据权利要求8所述的制备sgRNA载体的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将序列如SEQIDNO：1-6所示的任一项sgRNA靶序列和/或SEQIDNO：7-13所示的任一项sgRNA靶序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；优选的，所述sgRNA靶序列为SEQIDNO：3和SEQIDNO：8，获得的正向寡核苷酸序列如SEQIDNO：15或SEQIDNO：19所示；反向寡核苷酸序列如SEQIDNO：17或SEQIDNO：21所示，其中SEQIDNO：15和SEQIDNO：17为A组，SEQIDNO：19和SEQIDNO：21为B组；(2)合成含有T7启动子及sgRNAscaffold的片段DNA，其中含有T7启动子及sgRNAscaffold的片段DNA如SEQIDNO：22所示，将上述片段通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；(3)分别合成步骤(1)中所述的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，优选为A组和B组中的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤(2)所述的pT7-sgRNA载体的双链；(4)将步骤(3)中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。10.一种细胞，所述细胞包含权利要求1-4任一所述的靶向载体、一种或多种权利要求7所述的构建体和/或一种或多种权利要求7所述构建体的体外转录产物。优选的，所述细胞包含权利要求1-4任一所述的靶向载体和一种或多种权利要求7所述构建体的体外转录产物。11.权利要求1-4任一所述的靶向载体、权利要求5所述的sgRNA序列、权利要求7所述的构建体、权利要求8-9任一所述的方法获得的sgRNA载体或权利要求10所述的细胞在构建包含TIM-3基因人源化的非人动物或其子代中的应用。12.一种构建TIM-3基因人源化的非人动物或其子代的方法，其特征在于，所述方法包括导入人TIM-3基因、使得该人TIM-3基因在非人动物或其子代细胞中表达并且促进该细胞产生人源化的TIM-3蛋白，同时降低或消除了非人动物或其子代的体内内源/动物来源的Tim-3基因的表达。13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述方法包括：(a)构建含有人TIM-3基因的载体，通过基因工程方法将所述人TIM-3基因的载体导入非人动物的基因组，使得非人动物基因组中的内源/动物来源的Tim-3基因缺失或使得内源/动物来源的Tim-3蛋白不表达或不具有功能；并且(b)在所述非人动物或其子代体内表达人源化TIM-3蛋白。14.根据权利要求12-13任一所述的方法，其特征在于，所述动物基因组中包括人源化TIM-3基因，所述人源化TIM-3基因编码的蛋白包括胞外区、跨膜区以及胞内参与信号传导的区域，其中编码胞内参与信号传导的人源化TIM-3基因的区域为动物来源，编码胞外区的人源化TIM-3基因的区域包含人TIM-3基因的全部或部分片段，同时该动物来源部分和人源部分通过序列拼接连接于动物内源的Tim-3启动子后。优选的，编码跨膜区的人源化TIM-3基因的区域为动物来源。15.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈月雷，倪健，郭雅南，黄蕤，张美玲，赵磊，白阳，
申请(专利权)人：北京百奥赛图基因生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11