人源化基因改造动物模型的制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及人源化基因的基因改造非人动物，特别是基因改造啮齿动物，但尤其是基因改造小鼠，具体涉及人源化LAG‑3基因动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。

【技术实现步骤摘要】
人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
本申请涉及人源化基因改造动物模型的建立方法及应用，具体而言，涉及基于一种人源化LAG-3基因改造动物模型的构建方法及其在生物医药的应用。
技术介绍
免疫疗法通过激活免疫系统攻击并杀死癌症细胞，是肿瘤研究的一个重要领域，近十年来已经应用在临床治疗中。研究表明，以T细胞的抑制性受体为目标进行治疗效果显著，是当前靶向基因治疗最成功的领域。其中，靶向CTLA-4和PD-1/PD-L1的单克隆抗体已经取得确切疗效，但病人的应答率较低，还不能充分满足临床需求，更多靶向其它的抑制性受体的新型药物正在或已经进入临床研究。淋巴细胞活化基因-3分子(lymphocyteactivationgene3，LAG-3)属于免疫球蛋白超家族，由胞外区、跨膜区和胞质区3个部分组成，是目前已经确定的T细胞抑制性受体之一。LAG-3主要表达在活化的T细胞、NK细胞和DC细胞上，通过与其配体组织相容性复合体Ⅱ类分子(majorhistocompatibilitycomplexclassⅡ，MHCⅡ)结合，负调控T细胞功能。已有证据表明，LAG-3在多种免疫应答类型中发挥了重要调控作用，特别是在肿瘤免疫中。LAG-3在多种血液系统肿瘤和实体肿瘤中异常表达，且与多项病理参数和预后密切相关。LAG-3抑制剂或阻碍其信号通路能增强特异性CD8+T细胞的抗肿瘤作用。此外，联合阻断LAG-3和PD-1可能是通过增加效应T细胞的比例起到减缓肿瘤生长的协同作用。可见抗LAG-3治疗联合其它多个信号分子，在临床上对改善肿瘤免疫治疗疗效具有应用价值，可能是今后研究的重要方向之一。实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和药物是不可缺少的研究工具。目前与LAG-3相关的实验动物很少。ToruMiyazaki(1996)等人利用同源重组技术，将小鼠Lag-3基因上1-3号外显子用新霉素抗性基因替换，制备出Lag-3基因敲除小鼠。该小鼠NK细胞功能受损，对靶细胞的杀伤作用减弱或消失。进一步的研究证实该小鼠抗原特异性CD8+T细胞增殖增加；CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量较野生型增加，但两者比值未观察到明显变化。此外，该小鼠制备过程中使用的胚胎干细胞(ES细胞)来源于129遗传背景的小鼠，得到嵌合鼠后需与C57BL/6进行多次回交。该方法缺陷在于：一般需要超过10代的回交才能获得纯合子，回交往往需要2年的时间，耗费时间、资金和科研精力；另一方面，回交次数不同也会造成试验结果重复性差。由于目前的模型小鼠存在上述缺陷，且LAG-3基因在肿瘤免疫治疗领域具有巨大应用价值，为了使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本专利技术在世界范围内首次提供一种建立人源化LAG-3基因改造动物模型的新方法，并得到世界首例LAG-3基因人源化动物。具体来说，本专利技术的目的是制备一种非人动物模型，该动物体内可正常表达LAG-3蛋白，且表达的LAG-3蛋白能识别并结合人LAG-3抗体/抗原。此外，使用本方法制备的LAG-3基因人源化动物还可与其它基因改造人源化动物交配，得到双人源化或多人源化动物模型。本方法在肿瘤药物筛选等方面有着广阔的应用前景。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术惊奇的发现利用创造性劳动筛选设计独特的sgRNA序列，使非人动物LAG-3基因的特定片段被人LAG-3基因特定片段替换，本专利技术成果得到世界首例LAG-3基因人源化小鼠。成功制备LAG-3基因人源化的模式动物，该模型体内可正常表达LAG-3嵌合蛋白，可用于LAG-3基因功能研究、靶向LAG-3人源抗体的筛选和评价。利用本专利技术制备的动物模型可用于针对人LAG-3靶位点的药物筛选、药效研究，免疫相关疾病和肿瘤治疗等应用，加快新药研发过程，节约时间和成本，降低药物开发风险。对于研究LAG-3蛋白的功能和肿瘤药物筛选等提供了有力工具。同时还得到基因敲除动物模型。以及利用本模型可以与其它人源化动物模型(包括但不限于，人源化PD-1动物模型)交配得到双基因人源化动物模型或多基因人源化动物模型，可用于联合用药情况下筛选抗体及联合用药的药效评价等。本专利技术的第一方面，涉及一种靶向载体，其包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自LAG-3基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；b)插入或替换的供体DNA序列，其编码供体转换区；和c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自LAG-3基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。优选的，所述的靶向载体，其中，a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000072.6至少具有90％同源性的核苷酸，更优选的，所述与带改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自NCBI登录号为NC_000072.6的第124911766-124910898位核苷酸；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000072.6至少具有90％同源性的核苷酸，更优选的，所述与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，选自NCBI登录号为NC_000072.6的第124910116-124908702位核苷酸。优选的，所述的靶向载体，a)中选择的基因组核苷酸的长度为869bp，c)中选择的基因组核苷酸的长度为1415bp。优选的，所述的靶向载体，所述的待改变的转换区位于LAG-3基因第2外显子和第3外显子。更优选的，所述的待改变的转换区为第2外显子部分或全部和/或第3外显子部分或全部。优选的，所述的靶向载体，其中5’臂序列如SEQIDNO：32所示。优选的，所述的靶向载体，其中3’臂序列如SEQIDNO：38所示。优选的，所述的靶向载体，所述靶向载体还包括可选择的基因标记。优选的，所述的靶向载体，所述插入或替换的供体DNA序列来自人。进一步优选的，所述插入或替换的供体DNA为人LAG-3基因的核苷酸序列部分或全部。更优选的，所述人LAG-3基因的核苷酸序列包括人LAG-3基因DNA序列的第1号外显子、第2号外显子、第3号外显子、第4号外显子、第5号外显子、第6号外显子、第7号外显子和/或第8号外显子中的一个或多个。最优选的，所述的靶向载体，其中插入或替换的供体DNA序列为SEQIDNO：26所示的人LAG-3基因的核苷酸序列部分或全部。优选的，所述的靶向载体，其中所述人LAG-3的核苷酸序列编码如SEQIDNO：27所示的NCBI登录号NP_002277.4所示人LAG-3蛋白的部分或全部序列。人源DNA片段选自NCBI登录号为NC_000012.12的第6773206-6773988位核苷酸。优选的，所述的靶向载体，其中插入或替换的供体DNA序列如SEQIDNO：35所示。本专利技术的第二方面，涉及一种用于构建人源化动物模型的sgRNA序列，所述sgRNA序列靶向非人动物Lag-3基因，同时所述sgRNA在待改变的非人动物Lag-3基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则；优选的，所述非人动物为啮齿动物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种靶向载体，其包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自LAG‑3基因基因组DNA的100‑10000个长度的核苷酸；b)插入或替换的供体DNA序列，其编码供体转换区；和c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自LAG‑3基因基因组DNA的100‑10000个长度的核苷酸。

【技术特征摘要】
2016.11.11 CN 2016109934148;2017.06.09 CN 201710431.一种靶向载体，其包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自LAG-3基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；b)插入或替换的供体DNA序列，其编码供体转换区；和c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自LAG-3基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。2.根据权利要求1所述的靶向载体，其特征在于，a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000072.6至少具有90％同源性的核苷酸，优选的，所述与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自NCBI登录号为NC_000072.6的第124911766-124910898位核苷酸；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000072.6至少具有90％同源性的核苷酸，优选的，所述与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，选自NCBI登录号为NC_000072.6的第124910116-124908702位核苷酸。3.根据权利要求1-2任一所述的靶向载体，其特征在于，所述插入或替换的供体DNA序列来自人。优选的，所述插入或替换的供体DNA为人LAG-3基因的核苷酸序列部分或全部。进一步优选的，所述人LAG-3基因的核苷酸序列包括人LAG-3基因DNA序列的第1号外显子、第2号外显子、第3号外显子、第4号外显子、第5号外显子、第6号外显子、第7号外显子和/或第8号外显子中的一个或多个。4.一种用于构建人源化动物模型的sgRNA序列，其特征在于，所述sgRNA序列靶向非人动物Lag-3基因，同时所述sgRNA在待改变的非人动物Lag-3基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则。优选的，所述非人动物为啮齿动物。更优选的，所述啮齿动物为小鼠。优选的，所述sgRNA在小鼠Lag-3基因的靶位点分别位于小鼠Lag-3基因的第2外显子和第3外显子上。更优选的，sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQIDNO：1-7任一项所示，sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQIDNO：8-14任一项所示。进一步优选的，sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQIDNO：5所示，sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQIDNO：12所示。5.根据权利要求4所述的一种用于构建人源化动物模型的sgRNA序列，其特征在于，其识别5’端靶位点的sgRNA序列选自SEQIDNO：15和SEQIDNO：17、SEQIDNO：16和SEQIDNO：18；其识别3’端靶位点的sgRNA序列选自SEQIDNO：19和SEQIDNO：21、SEQIDNO：20和SEQIDNO：22。6.一种包含权利要求4-5任一所述的sgRNA序列的构建体。7.一种制备sgRNA载体的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提供一种sgRNA序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列，所述sgRNA序列靶向非人动物Lag-3基因，同时所述sgRNA在待改变的非人动物Lag-3基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则；(2)合成含有T7启动子及sgRNAscaffold的片段DNA，并将所述片段DNA通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；(3)将步骤(1)获得的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤(2)所述的pT7-sgRNA载体的双链；(4)将步骤(3)中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。8.根据权利要求7所述的制备sgRNA载体的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将序列如SEQIDNO：1-7所示的任一项sgRNA靶序列和/或SEQIDNO：8-14所示的任一项sgRNA靶序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；优选的，所述sgRNA靶序列为SEQIDNO：5和SEQIDNO：12，获得的正向寡核苷酸序列如SEQIDNO：16或SEQIDNO：20所示；反向寡核苷酸序列如SEQIDNO：18或SEQIDNO：22所示，其中SEQIDNO：16和SEQIDNO：18为A组，SEQIDNO：20和SEQIDNO：22为B组；(2)合成含有T7启动子及sgRNAscaffold的片段DNA，其中含有T7启动子及sgRNAscaffold的片段DNA如SEQIDNO：23所示，将上述片段通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；(3)分别合成步骤(1)中所述的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，优选为A组和B组中的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤(2)所述的pT7-sgRNA载体的双链；(4)将步骤(3)中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。9.一种细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求1-3任一所述的靶向载体、一种或多种权利要求6所述的构建体和/或一种或多种权利要求6所述构建体的体外转录产物。优选的，所述细胞包含权利要求1-3任一所述的靶向载体和一种或多种权利要求6所述构建体的体外转录产物。10.权利要求1-3任一所述的靶向载体、权利要求4-5任一所述的sgRNA序列、权利要求6所述的构建体或权利要求9所述的细胞、权利要求7-8任一所述方法产生的sgRNA载体在构建包含LAG-3基因人源化的非人动物或其子代中的应用。11.一种构建LAG-3基因人源化的非人动物或其子代的方法，其特征在于，所述方法包括导入人LAG-3基因、使得该人LAG-3基因在非人动物或其子代细胞中表达并且促进该细胞产生人源化的LAG-3蛋白，同时降低或消除了非人动物或其子代的体内内源/动物来源的Lag-3基因的表达。12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法包括：(a)构建含有人LAG-3基因的载体，通过基因工程方法将所述人LAG-3基因的载体导入非人动物的基因组，使得非人动物基因组中的内源/动物来源的Lag-3基因缺失或使得内源/动物来源的Lag-3蛋白不表达或不具有功能；并且(b)在所述非人动物或其子代体内表达人源化LAG-3蛋白。13.根据权利要求11-12任一所述的方法，其特征在于，所述动物基因组中包括人源化LAG-3基因，所述人源化LAG-3基因编码的蛋白包括胞外区、跨膜区以及胞内参与信号传导的区域，其中编码胞内参与信号传导的人源化LAG-3基因的区域为动物来源，编码胞外区的人源化LAG-3基因的区域包含人LAG-3基因的全部或部分片段，同时该动物来源部分和人源部分通过序列拼接连接于动物内源的Lag-3启动子后。优选的，编码跨膜区的人源化LAG-3基因的区域为动物来源。14...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈月雷，郭雅南，郭朝设，白阳，姚佳维，赵磊，黄蕤，
申请(专利权)人：北京百奥赛图基因生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11